本文關(guān)鍵詞：沙眼衣原體呼吸道感染小鼠肺組織γδT細(xì)胞及其亞群的增殖、活化和功能研究

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【摘要】：目的:γδT細(xì)胞是宿主固有免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞,它橋聯(lián)固有免疫和適應(yīng)性免疫,在抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和維持免疫耐受等方面發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。本研究用沙眼衣原體小鼠肺炎菌株(Chlamydia muridarum,Cm)經(jīng)呼吸道感染誘導(dǎo)小鼠沙眼衣原體肺炎。首先探討Cm呼吸道感染誘導(dǎo)的γδT細(xì)胞在感染肺組織的增殖、活化及功能。其次我們探討小鼠肺組織γδT細(xì)胞亞群的組成及其Cm感染后發(fā)生的變化;進(jìn)一步探討主要的γδT細(xì)胞亞群Vγ1+T和Vγ4+T細(xì)胞在沙眼衣原體呼吸道感染后的增殖、活化及分泌細(xì)胞因子IL-17和IFNγ的能力,從而明確γδT細(xì)胞及其亞群在小鼠衣原體肺炎中的作用,為胞內(nèi)菌感染免疫學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。方法:WT小鼠(C57BL/6鼠)經(jīng)鼻腔吸入1×103 IFU(衣原體包涵體形成單位)的沙眼衣原體小鼠肺炎菌株(Cm),建立小鼠沙眼衣原體肺炎模型。1.分離感染后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織單個(gè)核細(xì)胞,用熒光標(biāo)記的抗鼠CD3、TCRγδ及CD69抗體染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織CD3+TCRγδ+T細(xì)胞的百分率、CD69的表達(dá)水平,利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞IFNγ和IL-17的分泌,明確Cm感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞的增殖活化和功能。2.用Cm呼吸道感染W(wǎng)T小鼠和TCRδ-/-小鼠,每天監(jiān)測(cè)小鼠的一般狀況和體重變化,用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)小鼠肺組織衣原體包涵體形成單位(IFU),肺組織病理切片行HE染色觀察兩種小鼠肺組織炎癥,明確γδT細(xì)胞在衣原體肺炎中的作用。3.取健康小鼠及Cm感染后不同時(shí)間點(diǎn)的肺組織,利用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)肺組織γδT細(xì)胞各亞群mRNA的表達(dá),探討γδT細(xì)胞亞群在小鼠肺組織的分布及Cm感染后的變化。4.取Cm感染后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠肺組織單個(gè)核細(xì)胞,用熒光標(biāo)記的抗鼠CD3、TCRγδ、TCRVγ1和TCRVγ4抗體染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞占γδT細(xì)胞的百分比及其細(xì)胞數(shù),用抗鼠CD69抗體檢測(cè)Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞CD69的表達(dá),探討兩種γδT細(xì)胞亞群的增殖和活化;利用細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)分別測(cè)定Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞分泌IFNγ和IL-17的水平,探討小鼠肺組織γδT細(xì)胞亞群在Cm感染中分泌細(xì)胞因子的能力。結(jié)果:一定劑量的Cm經(jīng)呼吸道感染誘導(dǎo)小鼠沙眼衣原體肺炎。與未感染組比較,Cm感染誘導(dǎo)小鼠肺γδT細(xì)胞百分率及細(xì)胞數(shù)逐漸升高,于感染后第7天達(dá)到高峰(p0.01);Cm感染可誘導(dǎo)肺γδT細(xì)胞活化,CD69表達(dá)于感染后第3天及第7天水平顯著增高(p0.01,p0.05)。Cm感染誘導(dǎo)γδT細(xì)胞在感染早期(前3天)分泌大量IFNγ和IL-17參與宿主抗衣原體免疫應(yīng)答。TCRδ-/-小鼠在感染Cm后,表現(xiàn)出比WT小鼠更嚴(yán)重的疾病體征,說(shuō)明γδT細(xì)胞在沙眼衣原體感染中發(fā)揮一定的免疫保護(hù)作用。根據(jù)TCRγ鏈的不同,小鼠γδT細(xì)胞分為Vγ1+T、Vγ2+T、Vγ4+T、Vγ5+T、Vγ6+T、Vγ7+T 6個(gè)γδT細(xì)胞亞群,其組織分布尚無(wú)確切結(jié)論。我們首先對(duì)γδT細(xì)胞亞群在健康小鼠肺組織的分布進(jìn)行了研究,RT-PCR結(jié)果顯示,小鼠肺組織存在Vγ1+T、Vγ2+T、Vγ4+T、Vγ5+T、Vγ6+T 5種γδT細(xì)胞亞群,其含量Vγ2Vγ4Vγ1Vγ6Vγ5。在Cm感染后,肺Vγ4+T和Vγ1+T細(xì)胞含量顯著增高,Vγ4+T細(xì)胞在第3天達(dá)高峰(p0.001),Vγ1+T細(xì)胞在第7天達(dá)高峰(p0.001)。Vγ6+T細(xì)胞含量也在感染后有所增加,在第7天升高顯著(p0.01),Vγ2+T細(xì)胞和Vγ5+T細(xì)胞在感染后無(wú)顯著變化。用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)肺組織Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞占γδT細(xì)胞的百分率及細(xì)胞總數(shù),結(jié)果顯示Cm感染可誘導(dǎo)肺Vγ1+T細(xì)胞百分率及細(xì)胞數(shù)逐漸升高,于感染后第7天達(dá)到高峰(p0.01),之后下降,Vγ4+T細(xì)胞百分比和細(xì)胞數(shù)在感染后迅速升高,第3天達(dá)高峰(p0.001),隨后下降;活化分子CD69的表達(dá)結(jié)果顯示Vγ1+T細(xì)胞在感染后第7天活化百分比最高(p0.01),Vγ4+T細(xì)胞在第3天最高(p0.01);結(jié)合Vγ1-Vγ4-γδT細(xì)胞占肺總γδT細(xì)胞的比例,提示Cm感染在早期主要誘導(dǎo)Vγ4+T細(xì)胞增殖,感染中后期,Vγ1+T細(xì)胞成為增殖的主要γδT細(xì)胞亞群。對(duì)于以上兩群細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的研究顯示,Vγ1+T細(xì)胞在Cm感染后可分泌IFNγ但不分泌IL-17,Cm感染誘導(dǎo)的IFNγ產(chǎn)生在感染第7天達(dá)高峰(p0.01);而Vγ4+T細(xì)胞于感染后可同時(shí)分泌大量IFNγ和IL-17,Cm感染后其細(xì)胞因子分泌水平迅速升高,于感染后第3天達(dá)高峰(p0.001),之后下降,至感染中期降至基礎(chǔ)水平,結(jié)果表明Vγ4+T是γδT細(xì)胞在衣原體感染早期分泌IFNγ和IL-17參與免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞亞群。結(jié)論:沙眼衣原體呼吸道感染可誘導(dǎo)小鼠肺組織γδT細(xì)胞的增殖、活化并在感染早期分泌大量細(xì)胞因子IFNγ和IL-17,在Cm呼吸道感染中發(fā)揮免疫保護(hù)作用。小鼠正常肺組織中存在5種γδT細(xì)胞亞群:Vγ1+T、Vγ2+T、Vγ4+T、Vγ5+T、Vγ6+T,其中Vγ1+T和Vγ4+T細(xì)胞是Cm感染后肺組織γδT細(xì)胞增殖的主要亞群。Vγ1+T細(xì)胞可分泌IFNγ但不分泌IL-17,Cm感染可誘導(dǎo)其分泌IFNγ水平升高;Vγ4+T細(xì)胞可同時(shí)分泌IFNγ和IL-17,Vγ4+T細(xì)胞是γδT細(xì)胞在Cm感染早期分泌IFNγ和IL-17參與免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞亞群。
【關(guān)鍵詞】：沙眼衣原體 γδT細(xì)胞 Vγ1+T細(xì)胞 Vγ4+T細(xì)胞 IL-17 IFNγ
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 符號(hào)說(shuō)明12-13
• 前言13-18
• 研究現(xiàn)狀、成果13-16
• 研究目的、方法16-18
• 材料與方法18-30
• 1.實(shí)驗(yàn)材料18-23
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物18
• 1.2 實(shí)驗(yàn)菌種18
• 1.3 主要儀器和設(shè)備18-19
• 1.4 主要試劑19-20
• 1.5 主要試劑的配制20-23
• 2.實(shí)驗(yàn)方法23-30
• 2.1 沙眼衣原體的繁殖及鑒定23-24
• 2.2 小鼠肺炎模型的建立24
• 2.3 肺組織上清液中衣原體活性測(cè)定24-25
• 2.4 小鼠肺組織單個(gè)核細(xì)胞的制備25
• 2.5 小鼠脾組織單個(gè)核細(xì)胞的制備25-26
• 2.6 肺單個(gè)核細(xì)胞表面分子染色26
• 2.7 肺單個(gè)核細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)因子染色26-27
• 2.8 RT-PCR檢測(cè)27-28
• 2.9 統(tǒng)計(jì)分析28-30
• 結(jié)果30-49
• 1.γδT細(xì)胞參與宿主抗Cm呼吸道感染免疫應(yīng)答30-35
• 1.1 Cm呼吸道感染誘導(dǎo)肺組織 γδT細(xì)胞增殖30-31
• 1.2 Cm呼吸道感染誘導(dǎo)肺組織 γδT細(xì)胞活化31-32
• 1.3 Cm呼吸道感染誘導(dǎo)肺 γδT細(xì)胞分泌大量細(xì)胞因子32-33
• 1.4 γδT細(xì)胞參與宿主抗衣原體感染免疫保護(hù)33-35
• 1.5 小結(jié)35
• 2.小鼠肺 γδT細(xì)胞亞群及Cm感染誘導(dǎo)的 γδT細(xì)胞亞群的增殖35-38
• 2.1 小鼠肺組織 γδT細(xì)胞的多樣性35-36
• 2.2 Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞是小鼠Cm呼吸道感染誘導(dǎo)增殖的主要 γδT細(xì)胞亞群36-38
• 3.Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞在Cm呼吸道感染中的增殖及活化38-42
• 3.1 Vγ1+T細(xì)胞的增殖和活化38-39
• 3.2 Vγ4+T細(xì)胞的增殖和活化39-41
• 3.3 Vγ4+T和Vγ1+T細(xì)胞分別是感染不同時(shí)期小鼠肺組織的優(yōu)勢(shì) γδT細(xì)胞亞群41-42
• 4.Vγ1+T、Vγ4+T細(xì)胞在Cm呼吸道感染中的作用42-49
• 4.1 Cm呼吸道感染可誘導(dǎo)肺組織Vγ1+T細(xì)胞分泌IFNγ 但不分泌IL-1743-45
• 4.2 Cm呼吸道感染誘導(dǎo)肺組織Vγ4+T細(xì)胞分泌IFNγ 和IL-1745-47
• 4.3 Vγ4+T細(xì)胞是Cm呼吸道感染早期分泌IFNγ 和IL-17 的主要 γδT細(xì)胞亞型47-48
• 4.4 小結(jié)48-49
• 討論49-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 發(fā)表論文和參加科研情況說(shuō)明59-60
• 綜述 Vγ4γδT細(xì)胞在疾病中的研究進(jìn)展60-69
• 綜述參考文獻(xiàn)65-69
• 致謝69-70
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷70

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本文編號(hào)：713597