發(fā)布時間：2017-08-21 08:10

  本文關鍵詞：泛素和轉鐵蛋白受體表達載體的構建、表達和鑒定

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【摘要】：胞內體蛋白分選是泛素調控內吞作用中的關鍵步驟,不僅參與養(yǎng)分,代謝物,激素和生長因子的攝取,分選及處理;維持極性上皮細胞細胞質膜功能域的分布特點;受體和配體的再循環(huán)等多種過程,而且對于維持細胞的許多重要生理功能(如細胞周期的調控、抗原遞呈、信號轉導等)有著極其重要的作用。目前發(fā)現的許多遺傳性和獲得性疾病(如腫瘤、囊性纖維化)的發(fā)生都與此途徑功能失調相關。它也參與了機體抑制腫瘤、神經變性性疾病以及感染性疾病等病理過程,這說明其在細胞內具有非常重要的功能。胞內體蛋白分選轉運復合物(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)能將被泛素標記的蛋白分選入溶酶體途徑進行降解。ESCRT也在胞質分裂和病毒出芽過程中發(fā)揮重要作用。泛素-轉鐵蛋白受體(Ubiquitin-Transferrin receptor,Ub-Tf R)嵌合蛋白由于有泛素標記轉鐵蛋白受體,使其在胞內體上被分選進入多泡體/溶酶體的降解途徑,而不是沿著轉鐵蛋白受體通過再循環(huán)內體回到細胞質膜的經典途徑,是研究胞內體蛋白分選途徑共同機制的理想標記之一。所以我們通過構建泛素和轉鐵蛋白受體表達質粒的構建,為下一步的研究胞內體分選相關蛋白奠定基礎。方法:1.構建泛素表達載體采用PCR擴增小鼠泛素基因,經過雙酶切,將泛素基因克隆于表達載體p CI-neo-HA中,測序正確后提取質粒。2.泛素載體的表達測序正確的泛素表達質粒轉染Hela細胞,裂解細胞,收集細胞裂解液。通過Western blot檢測泛素蛋白的表達。3.構建轉鐵蛋白受體表達載體采用PCR擴增人轉鐵蛋白受體基因,經過雙酶切,將轉鐵蛋白受體基因克隆于表達載體p CI-neo-HA中,測序正確后提取質粒。4.轉鐵蛋白受體載體的表達及鑒定測序正確的轉鐵蛋白受體表達重組質粒轉染Hela細胞,裂解細胞,收集細胞裂解液。通過Western blot、免疫熒光等檢測轉鐵蛋白受體的表達。結果:1.泛素蛋白載體的構建、表達及鑒定通過設計特異性引物,經PCR擴增得到泛素基因片段約285bp,與預期相符;將擴增產物純化與載體質粒p Cl-neo-HA酶切后連接,送公司測序。測序正確后,轉染Hela細胞,轉染后裂解細胞,離心獲得細胞裂解液。Western Blot鑒定蛋白分子量為10KDa,表明為目的蛋白。2.人轉鐵蛋白受體表達系統(tǒng)構建、表達及鑒定通過設計特異性引物,經PCR擴增得到轉鐵蛋白受體基因片段約2309bp,與預期相符;將擴增產物純化與載體質粒p Cl-neo-HA酶切后連接,送公司測序。測序正確后,轉染Hela細胞,轉染后裂解細胞,離心獲得細胞裂解液。Western Blot鑒定蛋白分子量為90KDa,表明為目的蛋白。免疫熒光證實了轉鐵蛋白內吞后被分選循環(huán)回細胞膜的內吞途徑。結論:1.成功構建了p Cl-neo-Ub表達質粒,質粒轉染Hela細胞后表達的泛素蛋白明顯增高。2.成功構建了p Cl-neo-Tf R表達質粒,質粒轉染Hela細胞后表達的轉鐵蛋白受體蛋白明顯增高,并證實了轉鐵蛋白內吞后的循環(huán)途徑,為下一步構建泛素-轉鐵蛋白受體嵌合蛋白和進一步研究胞內體分選相關蛋白奠定了基礎。
【關鍵詞】：泛素 轉鐵蛋白受體 內吞 胞內體分選
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R3411
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-9
• 前言9-14
• 第一部分 泛素蛋白表達系統(tǒng)的構建、表達和鑒定14-28
• 1 材料與方法14-24
• 2 結果24-27
• 3 討論27-28
• 第二部分 轉鐵蛋白受體表達系統(tǒng)的構建、表達和鑒定28-45
• 1 材料與方法28-38
• 2 結果38-44
• 3 討論44-45
• 小結45-46
• 參考文獻46-50
• 綜述50-62
• 參考文獻57-62
• 縮略詞表62-63
• 在讀期間發(fā)表的論文63-64
• 致謝64

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本文編號：711751