本文關(guān)鍵詞：磁性人工抗原提呈細胞微孔反應(yīng)板的研制及抗原特異性T細胞數(shù)量和反應(yīng)活性的檢測，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：抗原特異性T淋巴細胞(Antigen-Specific T cell, AST)是介導適應(yīng)性免疫應(yīng)答的核心細胞,在抗感染、抗腫瘤、超敏反應(yīng)、自身免疫病以及移植排斥中都起著至關(guān)重要的作用,其數(shù)量的多寡和功能的強弱能直接反映人體特異性細胞免疫的功能狀態(tài)。但是,與特異性抗體的檢測相比,抗原特異性T細胞的數(shù)量和功能檢測都困難許多,方法少而復雜。目前pMHC多聚體熒光染色加流式細胞分析技術(shù)是抗原特異性T細胞數(shù)量檢測的金標準。但由于多聚體制備技術(shù)復雜,商品化產(chǎn)品種類少,且昂貴,不呈系列,限制了其廣泛應(yīng)用。針對抗原特異性T細胞數(shù)量和功能的檢測,無論是普遍應(yīng)用的酶聯(lián)免疫斑點法或細胞內(nèi)細胞因子染色法,還是pMHC多聚體流式染色法以及新近出現(xiàn)的pMHC芯片法和人工抗原提呈細胞芯片技術(shù)等,各有其優(yōu)勢和缺陷,每種方法單獨應(yīng)用于T細胞的檢測都不能簡單快速地同步進行細胞數(shù)量和功能的分析。因此創(chuàng)建一種簡單易行、可同步對抗原特異性T細胞進行數(shù)量和反應(yīng)活性檢測的新方法成為一個新的探索方向。為此,本研究利用商品化的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體作為靶向抗原,包被在直徑4.5微米的磁珠表面制成磁珠式人工抗原提呈細胞(aAPC-beads),以O(shè)T-1轉(zhuǎn)基因鼠脾淋巴細胞群中的OVA抗原特異性T細胞作為待檢的靶細胞,建立了磁性人工抗原提呈細胞微孔反應(yīng)板技術(shù)(aAPC-microplate),優(yōu)化了實驗方案,并著重進行了方法學論證。該技術(shù)的基本方案是：將aAPC-beads與OT-1鼠脾淋巴細胞以1：1的比例接種在已包被有抗IFN-γ抗體的透明酶聯(lián)免疫斑點微孔板(ELISPOT板)中共孵育2小時,然后在96孔板式磁場的作用下分選與磁珠結(jié)合的OVA抗原特異性T細胞,光鏡下計數(shù)分選所得細胞數(shù),計算其占接種的淋巴細胞數(shù)的比例；繼而在分選孔中加入抗原性刺激物,置細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24小時,激發(fā)OVA抗原特異性T細胞活化并分泌細胞因子,最后用ELSIPOT技術(shù)檢測分泌IFN-γ的細胞,計數(shù)斑點數(shù),計算分選所得細胞群中有反應(yīng)活性的細胞比例。另外,由于商業(yè)化二聚體H-2Kb-Ig/dimer價格昂貴,且我們后續(xù)實驗必須用自制的多聚體進行方法學論證,故我們用OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα鏈胞外區(qū)以及Avi標簽和His6標簽重組成單鏈融合基因,構(gòu)建重組質(zhì)粒,進而進行表達、提取和純化制備SCT復合物。本論文的主要結(jié)果如下：1、aAPC-microplate優(yōu)化方案(CD8-T細胞預分選)檢測OVA抗原特異性T細胞的數(shù)量時,每個待檢細胞樣品設(shè)5.個檢測數(shù)量組,海個細胞數(shù)量組設(shè)置3個復孔,.每個數(shù)量組的陽性細胞數(shù)由復孔的平均值表示,最終的陽性細胞比例由5個檢測數(shù)量組的直線回歸方程校正得出。方法學的準確性分析顯示：磁珠分選所得細胞數(shù)與接種的淋巴細胞數(shù)之間呈現(xiàn)了良好的數(shù)量依賴關(guān)系和線性關(guān)系,R2值達到0.99以上。5只OT-1鼠脾淋巴細胞群中OVA抗原特異性T細胞的比例分別為11.27%、9：40%、12.62%、14.77%和21.85%；經(jīng)典的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光染色及流式分析結(jié)果分別為13.69%、10.13%、16.88%、16.77%和21.45%。兩組數(shù)據(jù)問無統(tǒng)計學差異,相關(guān)系數(shù)為0：9280；PE-anti-mouse TCR Vα2熒光染色及流式分析結(jié)果分別為15.94%、18.23%、32.08%、31.29%和42.88%,明顯高于H-2Kb-Ig/OVA257-264 二聚體熒光染色結(jié)果和aAPC-microplate檢測法結(jié)果,差異顯著(p0.05),相關(guān)系數(shù)分別為0.85-0和-8054。特異性分析顯示：用無關(guān)抗原肽的Kb/TRP2-beads同步分選OT-1鼠脾淋巴細胞群時,陽性細胞比例則降為0.45%左右；經(jīng)Kb/OVA-beads磁珠分選后所得細胞群中的OVA抗原特異性T細胞比例經(jīng)H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光染色及流式分析為84.48%和89.80%(兩次實驗結(jié)果),而分選前的比例為13.69%和10.13%。重復性分析顯示：在5個檢測數(shù)量組之間,陽性細胞比例的平均批內(nèi)CV值為4.4%；對同一份OT-1鼠脾淋巴細胞群進行三次重復實驗時,批間CV值為13.5%,陽性細胞比例分別為9.40%、9.77%和9.47%；R2值分別為0.9959、0.9970和0.9960。上述結(jié)果顯示aAPC-microplate優(yōu)化方案具有較高韻特異性、準確性和重復性以及與傳統(tǒng)檢測方法的相關(guān)性,提示了該技術(shù)檢測抗原特異性T細胞數(shù)量的可行性。2、aAPC-microplate優(yōu)化方案同步檢測OVA抗原特異性T細胞的數(shù)量和反應(yīng)活性時,經(jīng)過磁珠分選和計數(shù)后,兩只OT-1鼠脾淋巴細胞群中OVA特異性T細胞比例為12.62%和21.85%,與經(jīng)典的pMHC二聚體熒光染色法的結(jié)果(16.88%和21.45%)相近。在3種不同形式和性質(zhì)的刺激物中,PHA刺激OVA抗原特異性T細胞活化并分泌IFN-y的能力最強,反應(yīng)活性比達59.91-63.99%；其它兩種刺激劑(磁珠式aAPC-beads,游離的OVA多肽+anti-CD28)的刺激能力次之,反應(yīng)活性比在45.14-54.35%,且相互間差異不顯著。這提示了aAPC-microplate技術(shù)在評價抗原特異性T細胞活性功能方面的可行性。3、通過PCR技術(shù)將兩個寡核苷酸接頭(Linker)與OVA257-264抗原肽、β2m、H-2Kbα鏈胞外區(qū)以及Avi標簽和His6標簽重組成單鏈融合基因,成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒,在BL21菌中表達、提取和純化了H-2Kb/OVA單鏈三聚體包涵體蛋白(SCT),并在體外通過稀釋復性法折疊成H-2Kb/OVA SCT復合單體,通過生物素-親和素系統(tǒng)制備了PE標記的H-2Kb/OVA SCT四聚體。將H-2Kb/OVA SCT復合單體包被細胞大小的磁珠后用H-2Kb分子構(gòu)象特異性單抗進行熒光染色和流式分析,驗證了折疊后的H-2Kb/OVA SCT復合單體在磁珠表面具有正確的空間構(gòu)象和定向；利用PE-H-2Kb/OVA SCT四聚體對OT-1鼠脾淋巴細胞進行熒光染色和流式分析,檢測OVA抗原特異性T細胞的比例(19.90%),并與商品化的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體熒光染色結(jié)果(21.85%)相比較,初步驗證了H-2Kb/OVA SCT復合體與特異性TCR的結(jié)合能力。這些結(jié)果為下一步利用自制pMHC多聚體對aAPC-microplate技術(shù)重新進行方法學驗證奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：抗原特異性T細胞 磁珠式人工抗原提呈細胞 ELISPOT
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-10
• 主要英文縮寫詞10-12
• 前言12-16
• 文獻綜述16-29
• 參考文獻25-29
• 第一節(jié) OT-1鼠脾細胞中OVA抗原特異性T細胞數(shù)量的檢測29-61
• 引言29-31
• 1. 材料和試劑31-32
• 2. 方法32-37
• 3. 結(jié)果37-59
• 4. 討論59-61
• 第二節(jié) OT-1鼠脾細胞群中OVA抗原特異性T細胞數(shù)量和功能的同步檢測61-83
• 引言61-62
• 1. 材料和試劑62-63
• 2. 方法63-67
• 3. 結(jié)果67-82
• 4. 討論82-83
• 第三節(jié) H-2Kb/OVA SCT重組質(zhì)粒的構(gòu)建及SCT蛋白構(gòu)象與功能的驗證83-100
• 引言83-84
• 1. 材料和試劑84-86
• 2. 方法86-94
• 3. 結(jié)果94-98
• 4. 討論98-100
• 小結(jié)與展望100-101
• 參考文獻101-105
• 致謝105-106
• 作者簡介106-107
• 附件107

【參考文獻】

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本文編號：416398