人腫瘤壞死因子α(TNF-α)是一種由體內(nèi)激活的單核巨噬細胞產(chǎn)生的細胞因子。體內(nèi)外試驗表明其對多種腫瘤細胞株有顯著的殺傷作用，尤其是局部應(yīng)用TNF-α進行抗腫瘤治療的效果明確。TNF-α是一由157個氨基酸組成的非糖基化多肽蛋白，分子量為17350Da；其生物活性形式為三聚體。目前重組TNF-α主要在大腸桿菌中克隆和表達。但是大腸桿菌的生長需要較多貴重的生化制劑；此外大腸桿菌自身含有毒蛋白，從而使大腸桿菌表達的TNF-α純化工藝復(fù)雜化。藍藻是一類光合自養(yǎng)原核生物，可作為各類生化過程研究的理想模式。由于藍藻的生長只需陽光、二氧化碳和少數(shù)無機鹽，其自身一般不含毒蛋白；加上藍藻的大規(guī)模培養(yǎng)具有經(jīng)濟和潔凈等特點，因此可將藍藻作為大腸桿菌重組DNA產(chǎn)品生產(chǎn)的替代宿主。為探討利用重組藍藻進行抗腫瘤細胞因子生產(chǎn)的可能性，我們將人TNF-α基因轉(zhuǎn)入單細胞絲狀魚腥藻7120中表達，并對表達產(chǎn)物進行初步的純化。 質(zhì)粒PT-TNF經(jīng)EcoR I和Xho I雙酶切后，分離回收含人TNF-α衍生物cDNA(0.7kb)片段。片段的Xho I酶切端經(jīng)Klenow聚合酶補平后，插入質(zhì)粒PRL439的psbA...

【文章頁數(shù)】：67 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 概論
    1.1 人腫瘤壞死因子的分子生物學(xué)進展
        1.1.1 人TNF分子理化特點
        1.1.2 人TNF基因及其表達產(chǎn)物的特征
        1.1.3 TNF受體的特性
        1.1.4 TNF的生物學(xué)效應(yīng)
        1.1.5 TNF的抗腫瘤機制
        1.1.6 TNF臨床抗腫瘤應(yīng)用展望
    1.2 藍藻基因工程進展
        1.2.1 藍藻的基因轉(zhuǎn)移
        1.2.2 外源基因在藍藻細胞中的穩(wěn)定存在
        1.2.3 表達載體
        1.2.4 外源基因在藍藻中的表達
    1.3 國內(nèi)外藻類基因工程制藥技術(shù)發(fā)展概況
    1.4 本課題研究的意義及主要研究內(nèi)容
        1.4.1 本課題研究的意義
        1.4.2 研究的主要內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 主要儀器設(shè)備
        2.1.2 主要試劑
        2.1.3 菌株和質(zhì)粒
        2.1.4 藍藻藻種和細胞株
        2.1.5 常用試劑配制
    2.2 實驗方法
        2.2.1 細菌質(zhì)粒DNA的快速提取和純化
            2.2.1.1 改良SET法快速制備質(zhì)粒DNA
            2.2.1.2 Quantum Prep小量DNA純化法
        2.2.2 質(zhì)粒的限制性內(nèi)切酶分析和酶切片段的回收
            2.2.2.1 限制性內(nèi)切酶分析
            2.2.2.2 酶切片段的回收
        2.2.3 DNA片段末端補平
        2.2.4 DNA片段的連接和轉(zhuǎn)化
            2.2.4.1 連接
            2.2.4.2 轉(zhuǎn)化
        2.2.5 魚腥藻Anabaena sp.PCC7120的培養(yǎng)和保種方式
        2.2.6 三親結(jié)合轉(zhuǎn)移
        2.2.7 藍藻質(zhì)粒DNA的提取
        2.2.8 隨機引物法制備³²P-DNA探針
        2.2.9 Southern印跡雜交法
            2.2.9.1 Southern轉(zhuǎn)移-把凝膠電泳上的DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜
            2.2.9.2 Southern膜的雜交
        2.2.10 TNF-α產(chǎn)物的表達及電泳鑒定方法
            2.2.10.1 TNF-α在大腸桿菌TG1中的表達
            2.2.10.2 TNF-α在魚腥藻7120中的表達
            2.2.10.3 表達產(chǎn)物的電泳鑒定方法
        2.2.11 蛋白質(zhì)免疫印跡分析(Western Blotting)
            2.2.11.1 電轉(zhuǎn)移
            2.2.11.2 免疫學(xué)檢測
        2.2.12 轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120的組織形態(tài)學(xué)檢查和生長曲線測定
            2.2.12.1 普通光鏡觀察
            2.2.12.2 透射電鏡觀察
            2.2.12.3 生長曲線測定
        2.2.13 rhTNF-α的初步分離純化和鑒定
            2.2.13.1 分離純化
            2.2.13.2 鑒定
第三章 結(jié)果與討論
    3.1 穿梭表達載體(PDC-TNF)的構(gòu)建及鑒定
        3.1.1 中間載體PRL-TNF的構(gòu)建
        3.1.2 PDC-TNF的構(gòu)建
        3.1.3 SDS-PAGE和Western Blotting分析
    3.2 TNF-α在魚腥藻7120中的表達和檢測
        3.2.1 PDC-TNF三親結(jié)合導(dǎo)入單細胞絲狀魚腥藻7120細胞
        3.2.2 轉(zhuǎn)基因魚腥藻7120質(zhì)粒提取和Southern雜交分析
        3.2.3 SDS-PAGE和Western Blotting分析TNF-α基因在魚腥藻7120中的表達
    3.3 轉(zhuǎn)PDC-TNF魚腥藻7120的組織學(xué)檢查和生長曲線測定
        3.3.1 組織學(xué)檢查
        3.3.2 生長曲線的測定
    3.4 轉(zhuǎn)TNF基因魚腥藻7120的穩(wěn)定性
    3.5 rhTNF-α的初步分離純化和生物學(xué)活性檢測
        3.5.1 TNF粗提液制備結(jié)果
        3.5.2 陰離子交換柱層析純化結(jié)果
第四章 結(jié)論與展望
參考文獻
致謝
在讀期間發(fā)表的論文
在讀期間參加的重要學(xué)術(shù)會
在讀期間獲得的科研成果



本文編號：3884287