本文關鍵詞：RACK1在肝細胞自噬中的作用和潛在的分子機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景:復雜的信號網絡在細胞生長、衰老、死亡等多種生命活動中起著重要的調節(jié)作用,這些信號網絡的形成是由具有一定特異性的相對少量的信號分子(即支架蛋白)來完成的。激活的蛋白激酶C受體1(RACK1,基因名Gnb2l1)就是這樣的一種支架蛋白。RACK1分子量為36 kDa,含有7個WD40重復序列,與G蛋白β亞基具有高同源性,在信號傳導過程中可以作為錨定蛋白和穿梭蛋白以參與信號的傳導或活化。大量研究表明RACK1在肝細胞癌等腫瘤的惡性生長中有著重要促進作用。而且RACK1在肝組織中高水平表達,但其在肝臟中的病理生理作用還是未知的。自噬是一個高度保守的細胞固有的生命進程,這個過程中,細胞的一些多余的成分或衰老的器官被轉運到溶酶體降解或者分解。以此作為機體重要的降解去路而存在。在肝臟中,自噬促進脂肪降解,有利于脂代謝穩(wěn)態(tài)的維持。自噬的啟動自噬的啟動需要AMPK活化或mTOR活性受抑導致的ULK1活化,接著ULK1磷酸化Beclin1導致自噬起始復合體ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15形成,MAPK家族成員JNK對Bcl2的磷酸化促使Bcl2與Beclin1解離,也有利于自噬起始復合體形成。Class III PI3K VPS34(也稱為PIK3C3)激酶活性在復合物形成后升高,催化磷脂酰肌醇(PI3P)生成,招募DFCP1形成Omega小體,進而ATG12-ATG5共價結合,促進膜延伸和閉合,誘導LC3B從胞漿型(LC3B I)轉變?yōu)槟ば?LC3B II)、促進自噬體的形成。但是自噬起始復合體的形成機制還不清楚。我們的研究發(fā)現,RACK1對自噬有促進性作用,并且參與自噬起始復合體的形成,RACK1缺失導致肝細胞脂肪堆積。這將為自噬的相關機制的研究和脂肪肝的治療方面的探索提供一些依據。目的:在肝來源細胞中探索RACK1對自噬是否有影響;探討RACK1預防肝細胞脂肪堆積的作用;分析RACK1影響自噬的分子機制。方法:以饑餓或mTOR抑制因子處理誘導自噬,以氯喹阻斷溶酶體活性;在上述處ii理前后通過westernblot檢測自噬相關指標lc3bii和atg12-atg5等的表達;透射電鏡觀察饑餓誘導自噬小體和脂肪滴的形成;nilered染色分析脂肪堆積;免疫熒光分析dfcp1opuncta的形成;激酶活性分析的方法檢測vps34活性;免疫沉淀與銀染、質譜鑒定相結合尋找rack1相互作用蛋白;利用免疫共沉淀的方法驗證rack1和自噬起始復合體atg14l-beclin1-vps34-vps15之間的相互作用;利用gst-pulldown的方法檢測體外翻譯的自噬起始復合體成分和rack1的直接結合。結果:1)rack1促進自噬并抑制肝細胞中脂肪堆積在肝來源細胞系中敲低內源rack1的表達,自噬標志物lc3bii的本底水平和饑餓誘導的lc3bii生成顯著降低。rack1敲低的情況下,mtor抑制因子和/或氯喹作用后的lc3bii水平也降低,說明lc3bii水平下降的原因是自噬減少而不是溶酶體活性過強。westernblot鑒定gnb2l1f/f;alb-cre(即gnb2l1?hep)小鼠表明,rack1在肝細胞中的表達缺失,但在其它組織中的表達與對照gnb2l1f/f小鼠無差異。gnb2l1?hep小鼠從生后4個月起肝臟變大、變黃;透射電鏡下可見6周大gnb2l1?hep小鼠的肝細胞脂肪滴增多而糖原減少、線粒體數量增多但體積變小;饑餓48小時后,gnb2l1f/f小鼠肝細胞中出現較多自噬小體,而gnb2l1?hep小鼠的肝細胞無自噬小體,并且線粒體膨脹、脂肪滴數量和體積增大。nilered染色證實了脂肪的堆積。westernblot表明饑餓前后gnb2l1?hep小鼠肝組織lc3bii生成均減少,證實rack1的缺失導致自噬水平的降低。2)rack1參與自噬的早期進程lc3bii的生成依賴于atg12-atg5的共價結合,westernblot表明饑餓前后gnb2l1?hep小鼠肝組織atg12-atg5生成均減少,提示rack1影響更早期的分子事件。在rack1敲低的肝來源細胞及其對照細胞中表達gfp-dfcp1,發(fā)現rack1敲低導致dfcp1opuncta形成的減少;并且整體vps34激酶活性或atg14l相關的vps34激酶活性均在rack1敲低或敲除的情況下降低,表明rack1參與自噬的早期進程。3)rack1促進自噬起始復合體的形成為了進一步揭示rack1參與自噬的分子機制,我們在rack1敲低的人肝來源細胞中表達GFP標簽的人源RACK1分子,由于GFP-RACK1也受RNA干擾作用的影響,表達量很低,可以作為內源RACK1分子發(fā)揮作用。免疫沉淀饑餓前后肝來源細胞中的“內源樣”GFP-RACK1分子,經銀染和質譜鑒定,發(fā)現了一個可能的RACK1結合蛋白VPS15,提示RACK1是自噬起始復合體的一個成分。免疫共沉淀證實了這一推測Gnb2l1?hep小鼠肝組織中,自噬起始復合體的形成顯著減少,說明RACK1促進自噬起始復合體的形成。4)RACK1形成二聚體并直接結合ATG14L,Beclin1,和VPS15在肝來源的細胞中表達外源的Flag-RACK1和GFP-RACK1,anti-FLAG免疫沉淀物中可以同時檢測到兩種不同標簽的RACK1的存在,并且在饑餓處理后1h時,FLAG-RACK1共結合的GFP-RACK1量升高最為明顯。GST-RACK1分別和體外翻譯的VPS15、VPS34、ATG14L、Beclin1進行GST-pull down分析,復合物中可以檢測到VPS15、ATG14L、Beclin1的存在,表明RACK1直接與ATG14L,Beclin1和VPS15結合。5)RACK1不影響AMPK,Ulk1,JNK活化Western Blot表明饑餓前后Gnb2l1?hep小鼠肝組織P-JNK,P-AMPK,P-Ulk1無缺陷。結論:肝細胞中,RACK1能夠穩(wěn)定自噬早期復合物的形成和促進自噬啟動,維持正常的自噬功能,從而維持細胞的穩(wěn)態(tài)和抑制脂肪堆積。
【關鍵詞】：RACK1 自噬 LC3B 自噬起始復合物 ATG14L-Beclin1-VPS34-VPS15
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-12
• 前言12-16
• 第一章 在肝來源細胞中檢測RACK1對自噬的影響16-24
• 第一節(jié) 在肝來源細胞系中探討RACK1對自噬的影響16-21
• 1 材料和方法16-19
• 2 結果19-20
• 3 討論20-21
• 第二節(jié) 肝來源細胞中RACK1對自噬流的影響21-23
• 1 材料與方法21
• 2 結果21-22
• 3 討論22-23
• 本章小結23-24
• 第二章 在條件性敲除RACK1的小鼠肝臟組織中探討RACK1對自噬影響24-34
• 第一節(jié) 條件性敲除RACK1的檢測24-27
• 1 材料和方法24
• 2 結果24-26
• 3 討論26-27
• 第二節(jié) 在小鼠肝組織中敲除RACK1對肝組織的影響27-32
• 1.材料與方法27-29
• 2 結果29-31
• 3 討論31-32
• 本章小結32-34
• 第三章 RACK1對自噬影響的機制探討34-59
• 第一節(jié) RACK1是對自噬體復合物的影響的探討34-38
• 1 材料和方法34
• 2 結果34-37
• 3 討論37-38
• 第二節(jié) RACK1對自噬起始復合體PI3KC3的活性分析38-41
• 1 材料和方法38-39
• 2 結果39-40
• 3 討論40-41
• 第三節(jié) RACK1自噬相關共結合復合物的檢測41-44
• 1.材料和方法41-42
• 2 結果42-43
• 3 討論43-44
• 第四節(jié) RACK1與自噬起始復合體各成分相互作用的探索44-48
• 1 材料和方法44
• 2 結果44-47
• 3 討論47-48
• 第五節(jié) RACK1和自噬起始復合體各成分之間相互作用形式的探索48-52
• 1 材料和方法48-50
• 2 實驗結果50-51
• 3 討論51-52
• 第六節(jié) RACK1在自噬起始復合體中存在形式52-55
• 1 實驗材料和方法52
• 2 實驗結果52
• 3 實驗結果討論52-54
• 4 結論54-55
• 第七節(jié) RACK1在自噬復合體中的作用的探索55-57
• 1 材料和方法55
• 2 實驗結果55-56
• 3 結論56-57
• 第八節(jié) RACK1對自噬影響的其它通路的探索57-58
• 1 材料和方法57
• 2 實驗結果57-58
• 3 結論58
• 本章小結58-59
• 全文總結59-60
• 參考文獻60-64
• 綜述 P62在自噬、凋亡和腫瘤中作用64-73
• 參考文獻71-73
• 碩士期間發(fā)表論文73-74
• 致謝74-76

【相似文獻】

中國碩士學位論文全文數據庫 前1條

1 趙亞偉;RACK1在肝細胞自噬中的作用和潛在的分子機制[D];河南大學;2015年

  本文關鍵詞：RACK1在肝細胞自噬中的作用和潛在的分子機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：344979