發(fā)布時間：2021-03-07 16:11

　　目的研究煙酰胺磷酸核糖轉移酶（nicotinamide phosphoribosyl transferase,Nampt）基因在人胚胎干細胞生長中的作用。方法采用CRISPR/Cas9技術對人胚胎干細胞H9細胞系的Nampt基因進行移碼突變;隨后,篩選Nampt基因突變細胞系進行基因測序,同時在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)。另外,給予H9細胞不同濃度的Nampt抑制劑FK866進行干預,采用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。結果 Nampt基因發(fā)生突變后,人胚胎干細胞會逐漸死亡。同樣,Nampt抑制劑FK866也會抑制胚胎干細胞的活力,使細胞逐漸死亡。結論 Nampt基因對維持人胚胎干細胞生長具有不可或缺的重要作用。 

【文章來源】：藥學實踐雜志. 2019,37(03)

【文章頁數(shù)】：4 頁

【部分圖文】：

圖１Ｎａｍｐｔ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９質粒載體示意圖

胞電轉后降低嘌呤霉素篩選濃度（０．１μｇ／ｍｌ）篩選５ｄ。待細胞系擴增后，挑取上述的單克隆提�。模危�，進行ＰＣＲ擴增后測序。結果顯示也無被編輯的細胞系。（３）為減少細胞死亡，在電轉后第１天添加ＲＯＣＫ抑制劑Ｙ２７６３２（１０μｍｏｌ／Ｌ）（僅第１天使用）［１１］，同時進行０．３μｇ／ｍｌ嘌呤霉素抗性篩選，３ｄ后得到混合細胞系，提�。模危梁�，進行ＰＣＲ擴增測序。測序結果顯示Ｎａｍｐｔ基因３個堿基被刪除，見圖２。７ｄ后再次對該混合細胞系提取ＤＮＡ進行ｓａｎｇｅｒ測序，結果顯示Ｎａｍｐｔ基因未被編輯。上述結果提示，Ｎａｍｐｔ基因突變是成功的，因為在電轉后的較早期（第３天），細胞ＤＮＡ測序結果顯示Ｎａｍｐｔ基因的３個堿基被刪除。但是電轉后期（第５天、第７天）檢測不到Ｎａｍｐｔ基因突變的細胞，說明該基因突變細胞已死亡。圖２基因測序結果注：框內為刪除的３個堿基３．３Ｎａｍｐｔ抑制劑ＦＫ８６６給藥結果如圖３所示，０．３、１、３和１０ｎｍｏｌ／Ｌ的Ｎａｍｐｔ抑制劑ＦＫ８６６對胚胎干細胞的生長抑制率分別為（２．９５±０．０１）％、（１３．７５±０．０１）％、（９０．０５±０．０１）％和（９５．６１±０．０２）％，各劑量組均有統(tǒng)計學差異，且ＦＫ８６６抑制人胚胎干細胞的生長呈劑量依賴性。從３ｎｍｏｌ／Ｌ劑量開始，ＦＫ８６６幾乎完全抑制胚胎干細胞生長。圖３ＦＫ８６６對胚胎干細胞生長的影響＊＊Ｐ＜０．０５，與對照組比較４討論Ｎａｍ

ｐｔ基因３個堿基被刪除，見圖２。７ｄ后再次對該混合細胞系提�。模危吝M行ｓａｎｇｅｒ測序，結果顯示Ｎａｍｐｔ基因未被編輯。上述結果提示，Ｎａｍｐｔ基因突變是成功的，因為在電轉后的較早期（第３天），細胞ＤＮＡ測序結果顯示Ｎａｍｐｔ基因的３個堿基被刪除。但是電轉后期（第５天、第７天）檢測不到Ｎａｍｐｔ基因突變的細胞，說明該基因突變細胞已死亡。圖２基因測序結果注：框內為刪除的３個堿基３．３Ｎａｍｐｔ抑制劑ＦＫ８６６給藥結果如圖３所示，０．３、１、３和１０ｎｍｏｌ／Ｌ的Ｎａｍｐｔ抑制劑ＦＫ８６６對胚胎干細胞的生長抑制率分別為（２．９５±０．０１）％、（１３．７５±０．０１）％、（９０．０５±０．０１）％和（９５．６１±０．０２）％，各劑量組均有統(tǒng)計學差異，且ＦＫ８６６抑制人胚胎干細胞的生長呈劑量依賴性。從３ｎｍｏｌ／Ｌ劑量開始，ＦＫ８６６幾乎完全抑制胚胎干細胞生長。圖３ＦＫ８６６對胚胎干細胞生長的影響＊＊Ｐ＜０．０５，與對照組比較４討論Ｎａｍｐｔ是哺乳動物體內ＮＡＤ生物合成的重要限速酶，在生物體內具有多種生理功能［６，１２］。另外，Ｎａｍｐｔ基因全身敲除的小鼠無法存活也說明了Ｎａｍｐｔ在生物體內的重要性［１３］。本課題組在Ｎａｍｐｔ相關研究上做了大量工作，尤其是發(fā)現(xiàn)其在缺血性腦卒中的亞急性期和慢性期可以通過促進血管新生和神經再生從而促進神經功能的恢復［１４－１５］。這些結果都提示Ｎａｍｐｔ在細胞的增殖分化上具有重要作用，但是目前Ｎａｍｐｔ在胚胎干


本文編號：3069418