發(fā)布時(shí)間：2021-01-07 03:47

　　皮肌炎／多肌炎是一類(lèi)自身免疫疾病，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。抗組氨�！猼RNA合成酶抗體，臨床上又稱(chēng)抗Jo-1抗體，是診斷這類(lèi)疾病的標(biāo)志性抗體。該類(lèi)疾病診斷的最佳方法是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），其靈敏度大大高于免疫雙擴(kuò)散（DID）和對(duì)流免疫電泳，但該方法前提是必須應(yīng)用高純抗原。生化提取的方法很難得到組分單一的純制品，只能依靠與標(biāo)準(zhǔn)血清或標(biāo)準(zhǔn)圖譜的對(duì)照來(lái)進(jìn)行鑒別。利用基因重組技術(shù)，制備單一性質(zhì)的重組Jo-1，可以特異、簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確地鑒別和診斷皮肌炎／多肌炎，有效地提高臨床診斷水平。 本實(shí)驗(yàn)從人胎盤(pán)中提取總RNA，利用RT-PCR技術(shù)獲得了編碼Jo-1的基因整長(zhǎng)序列，選用IMPACT-CN系統(tǒng)中的pTYB11載體，構(gòu)建了Jo-1基因的克隆與表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566，經(jīng)過(guò)抗性篩選、分子量大小比較、雙酶切鑒定、和PCR鑒定等多種方法驗(yàn)證，篩選出了5個(gè)陽(yáng)性克隆。通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)，獲得了重組的Jo-1融合蛋白，經(jīng)SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分析，產(chǎn)物分子量大小正確。Western blotting免疫檢驗(yàn)，該融合蛋白能被特異性抗體識(shí)別。但表達(dá)量不高，而且以包含體的形式存在。 

【文章來(lái)源】：河北大學(xué)河北省

【文章頁(yè)數(shù)】：46 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

pTYBll表達(dá)載體物理圖譜

2準(zhǔn)斗1盡5圖2總RNA無(wú)降解(見(jiàn)圖2)，可用于RT一PCR擴(kuò)一增。23000!飛們介〔!人胎盤(pán)總RNA電泳圖F19.2IsolationoftotalRNAfromhumanPlaeenta3.1.3RT一PCR擴(kuò)增人Jo一1基因片段以提取的總RNA為模板，用0119(dT)做反向引物，反轉(zhuǎn)錄第一條鏈。為了獲得目的片段，采用了嵌套引物，即首先以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，用第一對(duì)引物primerl、11進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物長(zhǎng)度為16O8bp，2%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，分子大小準(zhǔn)確，結(jié)果見(jiàn)圖3。主60810不》圖3第一對(duì)引物RT一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖1:RT一PCR產(chǎn)物:M:標(biāo)準(zhǔn)分子量(DL一2000)F19.3RT一PCRamPlifieationofJo一lgeneusingfirstPairofPrimers1:RT一PCRp

圖4Jo一1基因二次擴(kuò)增結(jié)果1基因片段，長(zhǎng)1585bp;4:為第一次擴(kuò)增.4PCRamPlifieationofJo一dPCR，1585BP;4:Produeto建腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)載體的選統(tǒng)表達(dá)N端為1ntein的融合基酸為丙氨酸(Ala)時(shí)，使洗脫，目的蛋白的純化效率最一個(gè)氨基酸為丙氨酸，為了使，


本文編號(hào)：2961847