【【背景】類鼻疽桿菌是一種能夠引起人類疾病甚至死亡的胞內(nèi)寄生菌,Ⅲ型分泌系統(tǒng)在該菌入侵上皮細(xì)胞、逃避宿主免疫以及毒力因子的分泌過程中發(fā)揮重要作用,其中bopA基因為TTSS-3基因編碼的重要效應(yīng)蛋白,在類鼻疽桿菌的免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。【目的】構(gòu)建類鼻疽桿菌bopA基因敲除菌株,并對其生物學(xué)特征進(jìn)行初步研究。【方法】構(gòu)建pK18mobSacB-ΔbopA自殺質(zhì)粒,通過大腸桿菌S17-1λpair以接合的方式轉(zhuǎn)入類鼻疽桿菌,利用同源重組敲除了bopA基因,并用蔗糖平板篩選出菌株,最后在細(xì)胞和動物水平檢測敲除菌株的表型變化。【結(jié)果】構(gòu)建了bopA敲除的類鼻疽菌株,并通過細(xì)胞和動物實驗證實敲除bopA基因后,細(xì)菌的細(xì)胞侵襲和胞內(nèi)存活以及體內(nèi)定殖能力都顯著降低。【結(jié)論】利用同源重組成功構(gòu)建類鼻疽bopA基因敲除株,為深入研究該基因的作用靶點奠定了實驗基礎(chǔ)。
【部分圖文】：

trol.2.3敲除菌株與野生株生長曲線以實驗室野毒株BPC006為對照，可見BPC006與BP(ΔbopA)菌株生長情況相似，均在12h達(dá)到對數(shù)生長期，而24h后進(jìn)入生長平臺期(圖5)。說明bopA基因敲除不影響B(tài)P細(xì)菌本身的生長活力。2.4bopA基因缺失對類鼻疽桿菌的細(xì)胞黏附率和侵襲率的影響作為類鼻疽桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的重要分子，bopA基因在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮著重要作用。為了驗證bopA基因敲除對細(xì)菌活力的影響，利用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7進(jìn)行了細(xì)菌的黏附和侵圖5bopA敲除菌與野生菌的生長曲線Figure5GrowthcurvesofbopAknockoutstrainandwild-typestrain

74.45%和0.12%。結(jié)果表明敲除bopA基因后，BP細(xì)菌黏附性增加，而進(jìn)入細(xì)胞的能力明顯降低。2.5bopA基因缺失對類鼻疽桿菌胞內(nèi)存活的影響類鼻疽桿菌可以侵入多種吞噬和非吞噬細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行增殖，發(fā)揮其細(xì)胞毒性，其在胞內(nèi)的存活情況與其抵抗細(xì)胞清除能力密切相關(guān)。通過胞內(nèi)存活實驗結(jié)果(圖6)可以看出bopA缺失株侵襲率明顯低于WT(結(jié)果同上)，感染初期細(xì)菌存活量減少，可能是感染早期激活了細(xì)胞自噬，4h后BPC006野生株在胞內(nèi)快速增殖，而敲除株在胞內(nèi)圖6bopA敲除菌與野生菌胞內(nèi)存活和增殖情況Figure6IntracellularsurvivalandproliferationofbopAknockoutstrainandwild-typestrain增殖緩慢甚至無法增殖，說明bopA基因在類鼻疽桿菌的免疫逃逸中具有重要的作用。2.6bopA基因缺失對類鼻疽桿菌感染后細(xì)胞形態(tài)影響類鼻疽桿菌主要是通過抑制LC3介導(dǎo)的吞噬作用，從吞噬體逃逸到細(xì)胞胞質(zhì)，一旦細(xì)菌進(jìn)入胞質(zhì)，就會激活BimA介導(dǎo)的肌動蛋白運動活性、大量繁殖并侵入鄰近細(xì)胞形成肌動蛋白尾和多核巨細(xì)胞(Multinucleargiantcell，MNGC)。由實驗結(jié)果(圖7)可以看出野生株感染4h后細(xì)胞形成肌動蛋白尾，而感染8h后大量細(xì)菌從細(xì)胞中逃逸出來，導(dǎo)致細(xì)胞肌動蛋白尾數(shù)量增多，并形成MNGC，而bopA敲除的菌株則沒有發(fā)生明顯的變化，且胞內(nèi)細(xì)菌數(shù)量少。2.7bopA基因缺失對類鼻疽桿菌的小鼠肝臟、脾臟以及肺載菌量的影響對分別腹腔注射BPC006和BP(ΔbopA)小鼠進(jìn)行觀察，注射BPC006的小鼠在第3天出現(xiàn)毛皮蓬亂、精神萎靡現(xiàn)象，而感染BP(ΔbopA)細(xì)菌的小鼠則未出現(xiàn)明顯的癥狀。通過小鼠肝臟、脾臟以及肺

盧曉雪等:類鼻疽伯克霍爾德菌bopA基因敲除株的構(gòu)建及生物學(xué)特征241Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn圖7細(xì)菌感染后細(xì)胞共聚焦圖片F(xiàn)igure7ConfocalmicrographswithDICimagesofRAW264.7cellsinfectedwithbopAknockoutstrainandwild-typestrain注：綠色：細(xì)胞骨架；藍(lán)色：細(xì)胞核；紅色：類鼻疽桿菌；白色箭頭：肌動蛋白尾；紅色箭頭：MNGC.Note:Green:F-actin;Blue:Nucleus;Red:BP;Whitearrow:Actintails;Redarrow:MNGC.自噬水平的重要標(biāo)志，而SQSTM1蛋白則是檢測自噬流是否通暢的重要標(biāo)志。一般情況下，自噬激活，MAP1LC3B表達(dá)量增加，同時LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高，自噬體與溶酶體融合，SQSTM1隨之被降解；反之則SQSTM1積蓄。已有研究表明，類鼻疽桿菌能夠圖8小鼠不同臟器載菌量Figure8BacterialcountofbopAknockoutstrainandwild-typestrainindiffentorgansofmiceNote:*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001.影響自噬體與溶酶體融合過程[9]，為了研究bopA基因缺失對類鼻疽桿菌感染后細(xì)胞自噬的影響，檢測了不同菌株感染后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)情況(圖9)。結(jié)果顯示BPC006和BP(ΔbopA)都能夠激活自噬(MAP1LC3B-Ⅱ明顯增加)，但不同于BPC006能夠通過抑制自噬流逃逸宿主免疫，BP(ΔbopA)感染后細(xì)胞SQSTM1蛋白明顯減少，自噬流通暢，與Rapa激活細(xì)胞自噬結(jié)果相同。圖9bopA敲除對BP感染后細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure9EffectofBPbopAgeneonautophagyrelatedproteinexpression
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本文編號：2860542