鈣調素(calmodulin，CaM)是一種廣泛存在于真核細胞中的Ca~(2+)結合蛋白，CaM-Ca~(2+)作為細胞內信號轉導途徑中的主要信號分子，介導調控由Ca~(2+)引起的一系列生理生化反應，調節(jié)細胞的增殖、分化、運動等過程。近年來的研究發(fā)現，鈣調素也同樣存在于動、植物細胞外，具有促進細胞增殖，神經軸突生長，抑制腫瘤壞死因子的釋放，以及促進中性粒細胞蛋白酶分泌等功能，CaM類似于細胞因子和肽類激素的特征，具有細胞外信號功能。有關細胞外CaM的作用機制目前尚不清楚。推測細胞表面可能存在的鈣調素結合蛋白(calmodulin-binding proteins, CaMBPs)，是介導細胞外CaM和胞內信號轉導的橋梁，起到傳遞細胞外CaM信號的作用。用免疫電鏡定位技術，證實細胞表面CaMBPs的存在和觀察其在不同細胞表面的分布特征，將有助于深入了解細胞外CaM的作用機制，及其與細胞增殖的關系，為疾病的診斷和治療提供線索。 已發(fā)現植物細胞壁存在CaMBPs。為證實哺乳動物細胞表面CaMBPs的存在，本研究用10nm膠體金標記重組人鈣調素(金-rhCaM)，分別與人外周血淋巴細胞、小鼠骨髓瘤細胞SP2／0、人胃癌細胞MGC803在體外反應24h后，用透射電鏡觀察，結果發(fā)現上述三種細胞表面均可見散在金顆粒分布，用金標記BSA代替金標記鈣調素與上述細胞作用，或淋巴細胞預先用未標記鈣調素封閉后再與金-rhCaM反應，透射電鏡觀察，細胞表面均未見金顆粒分布。提示在人外周血淋巴細胞、小鼠骨髓瘤細胞SP2／0和人胃癌細胞MGC803表面存在rhCaM結合位點(Camodulin-binding site, CaMBS)。從透射電鏡結果中也發(fā)現，小鼠骨髓瘤細胞(SP2／0)和人胃癌細胞(MGC803)表面CaM結合位點的密度要高于正常人外周血淋巴細胞，提示細胞膜表面CaMBS的分布可能與腫瘤細胞生長相關。 長期以來，鈣調素被認為是真核細胞的信號轉導分子。但近年來的研究發(fā)現，原核細胞中也存在鈣調素樣蛋白。我們此前的工作也證實外源性CaM可以促進結核分枝桿菌生長。推測原核生物的細胞壁也可能存在CaM結合位點。用金 第__軍醫(yī)大學領一卜學位論文 一rllCaM與新鮮培養(yǎng)的卡介苗(減毒牛結核分枝桿菌)進行反應，透射電鏡觀察 發(fā)現結核分枝桿菌細胞壁存在鈣調素結合位點。 大量研究表明，CaM結構與功能的異常以及細胞內CaM含量的變化與某些 疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，檢測細胞內外CaM的含量及其與疾病的關系，將有 助于進一步探討CaM的生物學功能及其在某些疾病的發(fā)生發(fā)展中的作用機制和 意義。由于CaM分子結構在進化上的保守性，難以制備特異性的優(yōu)質抗體，至 今還沒有理想的CaM檢測試劑盒適合于臨床常規(guī)應用。本研究在研制rhCaM和 兔抗CaM抗體的基礎上，通過對聚苯乙烯反應板進行紫外線照射處理;改善抗 原固相化條件，建立了簡便、快速、準確的競爭性ELISA定量方法，經方法學 考核，該法具有較高的敏感性，檢測CaM的最低下限為4Ong/ml:重復性較好， 可用于CaM的定量研究。對淋巴細胞性白血病9例、非淋巴細胞性白血病7例、 淋巴瘤7例和82例健康獻血員外周血單個核細胞細胞內CaM含量測定結果表 明，三組患者中外周血單個核細胞內CaM含量分別為1 349.3士206.38fg/cell、 556.06士108.02 fg/cell、1746.05士547.84fg/c ell，顯著高于正常對照組(107.16土56.07 倒cell)(P0.01)。提示白血病和淋巴瘤患者單個核細胞內CaM表達水平顯著 升高。 特異性抗體的制備是建立高特異、靈敏的ELISA檢測技術的重要環(huán)節(jié)。由于 CaM抗原分子量小，無種屬性差異，很難免疫動物獲得高效價、高親和力的特 異性抗血清。因此也限制了ELISA方法的敏感性。噬菌體抗體庫技術的發(fā)展， 為某些難以免疫動物產生特異抗體的抗原，提供了生產單克隆抗體的另一條可行 途徑。為此，我們采用噬菌體顯示技術，利用重組人鈣調素為篩選抗原，從人源 性噬菌體抗體庫中篩選抗CaM特異性抗體，以期得到高效、特異的抗CaM抗體。 從天然抗體庫中篩選抗原特異性抗體，篩選效率通常較低，成功率遠比從免疫抗 體庫中篩選低得多，技術難度較大。我們經過多次篩選方案改進，得到了陽性噬 菌體抗體克隆。用ELI SA試驗、鈣離子敏感性反應試驗、膠體金斑點試驗(反 相)證實其抗原特異性。得到了抗原結合活性較強的人源性CaM單鏈噬菌體抗 體。我們的改進方案可能對其它抗原的抗體庫篩選具有參考意義。
【學位單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R341
【部分圖文】：

體(由噬菌體基因改造而成)中，外源性蛋白基因直接插入噬菌體基因中，以寡價(p川融合)和多價(p姍融合)展示，因此展示水平較高。如果噬菌體上的p111蛋白都是融合的，空間位阻將阻礙plll與性菌毛結合，會導致感染能力下降。而p硼融合表達系統(tǒng)能容納的膚鏈長度有限，妨礙噬菌體的組裝。噬菌粒載體(是噬菌體與質粒的雜合體)更適合于展示抗體分子，容易導入新的基因，連接轉化效率高，能獲得較大的庫容‘。因此，噬菌體抗體庫多采用噬菌粒作為載體。3.2技術流程將Fab、ScFv的基因與少量衣殼蛋白基因p川相接，插入噬菌粒載體，轉染表達F菌毛的大腸桿菌，在宿主菌內合成后，抗體融合表達在plll的N端，借助信號膚穿膜作用，進入膜間隙。在輔助噬菌體超感染后，這些抗體片段一plll融合蛋白被包裝于噬菌體尾部。同時由于輔助噬菌體的復制缺陷，噬菌粒的DNA被優(yōu)先包裝進入噬菌體內核，因此攜帶有表達載體的宿主菌就會釋放出帶有抗體片段的噬菌體顆粒，并具有再次感染宿主菌進行復制的能力(圖1)。
【參考文獻】

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本文編號：2853454