發(fā)布時(shí)間：2020-08-20 18:28

【摘要】： 目的：大型頜骨缺損歷來是臨床修復(fù)的難點(diǎn)，盡管可供選擇的治 療手段很多，但很少有一種方法能比較理想地解決修復(fù)問題，獲得令人滿 意的效果。骨組織工程的提出為解決這一難題提供了新的途徑。成骨細(xì)胞 作為骨組織工程的種子細(xì)胞，它的獲取和培養(yǎng)是組織工程中最基礎(chǔ)和最為 重要的環(huán)節(jié)。在成骨細(xì)胞多種來源中，骨髓來源最為優(yōu)越。骨髓來源的成 骨細(xì)胞由骨髓內(nèi)骨祖細(xì)胞分化而來，但骨祖細(xì)胞數(shù)量有限，增殖較慢，難 以適應(yīng)種子細(xì)胞庫大量細(xì)胞的需要。本實(shí)驗(yàn)采用兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞作為骨組 織工程種子細(xì)胞的來源篩選培養(yǎng)兔成骨細(xì)胞，并觀察其生物學(xué)特性，為從 骨髓途徑獲取篩選種子細(xì)胞并應(yīng)用于骨組織工程修復(fù)頜骨缺損提供一定的 實(shí)驗(yàn)依據(jù)；并探討胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ（insulin-like growth factor Ⅱ，IGF Ⅱ）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、轉(zhuǎn)化 生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）這3種生長(zhǎng)因子單獨(dú)及交互 聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響，希望能選擇一種合適的促進(jìn)成骨細(xì)胞 增殖的方法，為成骨細(xì)胞適應(yīng)骨組織工程種子細(xì)胞庫的大量需要提供一定 的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：抽取日本大耳白兔骨髓液經(jīng)離心后得骨髓單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng) 兔成骨細(xì)胞的培養(yǎng)及生長(zhǎng)因子對(duì)其體外增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究 PBS液洗滌后以 IX 10fynd的細(xì)胞濃度進(jìn)行培養(yǎng)，2周后得到貼壁生長(zhǎng)的單 層細(xì)胞。隨后進(jìn)入傳代培養(yǎng)，通過倒置顯微鏡、HE染色、掃描電鏡、透 射電鏡、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）染色、I型膠原免疫組化染 色、鈣染色等手段對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性研究。然后將細(xì)胞與載體 材料聚乳酸（PLA）、膨體聚四氟乙烯（OPTFO復(fù)合培養(yǎng)1周后回植自體兔肌 肉內(nèi)，4周、巴周后植人部位取材，組織學(xué)方法觀察其體內(nèi)成骨能力。并采 用體外培養(yǎng)的第5代成骨細(xì)胞，用鷹陛藍(lán)比色法，觀察胰島素樣生長(zhǎng)因子 11、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因于、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子·p這三種生長(zhǎng)因于單獨(dú)及交 互聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)成骨細(xì)胞體外增殖的影響。 結(jié)果：在形態(tài)學(xué)上，本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞能夠貼壁，呈多種形態(tài)， 有粗細(xì)不均的胞漿突起，并且呈集落樣生長(zhǎng)，可相互重疊成復(fù)層生長(zhǎng)，并 形成細(xì)胞結(jié)節(jié)。電鏡下可見典型的蛋白質(zhì)合成結(jié)構(gòu)；胞漿富含線粒體、粗 面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，表明合成分泌功能旺盛，符合成骨細(xì)胞的形態(tài)及生 長(zhǎng)特性。在生化和”組織化學(xué)上，培養(yǎng)細(xì)胞富含ALP活性，主要合成1型膠 原，并且在條件培養(yǎng)基中可以鈣化（Von Kossa染色陽性）。符合成骨細(xì)胞 鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。且細(xì)胞經(jīng)連續(xù)傳代，形態(tài)與功能不變。成骨細(xì)胞經(jīng)體外增殖， 與載體復(fù)合培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好。植入體內(nèi)后早期（4周時(shí)）形成的骨基質(zhì)結(jié) 構(gòu)疏松，。周圍仍有較多成骨細(xì)胞，晚期（8周時(shí)）則可見形成的骨樣組織 結(jié)構(gòu)致密，內(nèi)有骨細(xì)胞位于骨陷窩中，與典型的骨組織結(jié)構(gòu)基本相似。 在相同培養(yǎng)條件下，三種生長(zhǎng)因子均能促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，IGF．H、 bFGF這兩種生長(zhǎng)因于在0．l－10．ong／thl濃度范圍內(nèi)與兔成骨細(xì)胞增殖呈劑 量·效應(yīng)關(guān)系，并以10．onglml這個(gè)濃度促增殖作用最為顯著，濃度超過該 值后，促增殖作用反而下降。TGF－D在0。olghl時(shí)促增殖作用最為顯著， 隨著濃度增高，作用下降。選擇較佳效應(yīng)濃度的3種生長(zhǎng)因于與兔成骨細(xì) 胞培養(yǎng) 1天后，除 10．0 il bFGF外，其余促增殖作用均不顯著，3天后 第2頁 兔成骨細(xì)胞的用養(yǎng)及生長(zhǎng)因于對(duì)其體外增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究 出現(xiàn)促增殖差異，5天后，生長(zhǎng)因子促進(jìn)兔成骨細(xì)胞增殖作用達(dá)到最大，7 天后，作用減弱。三種生長(zhǎng)因子交互作用時(shí)，對(duì)兔成骨細(xì)胞的增殖有協(xié)同 作用，均促進(jìn)兔成骨細(xì)胞的增殖，并以生長(zhǎng)因于 bFGF＋GF·11與 bFGF＋I(xiàn)GF·H可GF小聯(lián)合作用效果較為顯若。 結(jié)論： 二．兔骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后生長(zhǎng)活躍，具有與成骨細(xì)胞相似的形態(tài) 特征及生長(zhǎng)特點(diǎn)；具有較強(qiáng)的ALP活性，能分泌I型膠原，能體外鈣化； 細(xì)胞一載體復(fù)合物植入體內(nèi)八周后能形成骨組織。表明：我們從兔骨髓中 篩選培養(yǎng)成功的細(xì)胞是兔成骨細(xì)胞，從骨髓中獲取成骨細(xì)胞的方法是可行 的。 2．三種生長(zhǎng)因于均能促進(jìn)兔骨髓成骨細(xì)胞的增殖，生長(zhǎng)因子促增殖作用 有劑量依賴性和時(shí)間依賴性，三種生長(zhǎng)因子交互作用時(shí)有協(xié)同作用，提示 生長(zhǎng)因子在體外可促進(jìn)兔成骨細(xì)胞增殖，可作為在較短時(shí)間快速獲得骨組 織工程種子細(xì)胞一成骨細(xì)胞的一種有效的途徑。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：2798298