【摘要】： 自從1983年第一個(gè)轉(zhuǎn)基因植物問(wèn)世以來(lái)，植物基因工程的發(fā)展日新月異，在植物抗病毒、抗蟲(chóng)、抗除草劑、抗逆性品種改良和外源基因表達(dá)等方面取得了舉世矚目的成就，轉(zhuǎn)基因植物作為廉價(jià)的生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類(lèi)所需要的各種藥物原料展示了誘人的前景。水稻是世界上最重要、種植范圍最廣的糧食作物。當(dāng)今，以水稻為代表的禾本科植物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得了重大突破，水稻表達(dá)異種蛋白成為可能。通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，以水稻為表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)安全和廉價(jià)轉(zhuǎn)基因疫苗、抗體、乃至細(xì)胞因子，不僅是醫(yī)藥基因工程研究的進(jìn)步，也是使水稻從簡(jiǎn)單的糧食作物轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂懈吒郊又档墓δ苄允称返闹匾緩健?幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是慢性胃炎和消化性潰瘍的主要致病因子，并被WHO列為與胃癌發(fā)生密切相關(guān)的病原菌，認(rèn)為是人類(lèi)第Ⅰ類(lèi)致癌原(Group Ⅰ carcinogen)。疫苗的使用將是預(yù)防Hp感染的最有效方法。 本研究擬通過(guò)植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將Hp ureB基因和佐劑CTB基因轉(zhuǎn)入水稻染色體DNA，并獲得穩(wěn)定遺傳的再生植株，為建立以水稻為生物反應(yīng)器表達(dá)微生物抗原及其Hp轉(zhuǎn)基因植物疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。 方法 1．構(gòu)建CTB基因的水稻表達(dá)載體p13W4-CTB：以pGEM-CTB為模板，PCR擴(kuò)增CTB基因，BamHI酶切載體p13W4并去磷酸化，然后與同樣酶切的CTB PCR產(chǎn)物連接，PCR篩選、酶切鑒定陽(yáng)性克隆，進(jìn)行DNA序列分析驗(yàn)證。 2．構(gòu)建CTB-ureB融合基因的水稻表達(dá)載體pCWUN： (1)CTB、ureB基因的融合及克�。翰捎酶弑Ｕ鍼CR技術(shù)，分別從質(zhì)粒pGEM-CTB和幽門(mén)螺桿菌基因組DNA中擴(kuò)增出CTB和cagA基因，然后通過(guò)PCR法融合兩個(gè)基因，最后將CTB-ureB融合基因插入載體pUC19，PCR篩選、酶切鑒定陽(yáng)性克隆，進(jìn)行DNA序列分析驗(yàn)證。 (2)水稻W(wǎng)x啟動(dòng)子的改造：采用高保真PCR技術(shù)，從質(zhì)粒p13W4中擴(kuò)增出Wx啟動(dòng)子，ΩK5′ 和3’引物72℃退火延伸獲得產(chǎn)物OK片段，然后通過(guò)PCR法融合兩個(gè)片段，獲得Wx一QK融合片段。 (3) CTB一ureB融合基因的水稻表達(dá)載體pCWUN:PCR合成NoS終止子，從質(zhì)粒PUCU上切下 CTB一ureB融合基因，然后依次將NOS終止子、CTB一ureB融合基因和Wx一OK融合片段插入質(zhì)粒 PCAMB認(rèn)1300，篩選、鑒定重組質(zhì)粒PC認(rèn)幾刀叮。 3.水稻表達(dá)載體P13w4一cTB和pcWIJN分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)根瘤土壤桿菌，經(jīng)過(guò)PcR篩選和酶切鑒 定，獲得根瘤土壤桿菌轉(zhuǎn)化子。 4.水稻幼胚誘導(dǎo)胚性愈傷組織，然后根瘤土壤桿菌介導(dǎo)表達(dá)載體P13W4一C，轉(zhuǎn)化水稻胚性愈傷 組織，經(jīng)過(guò)抗性篩選、分化和生根培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因植株，PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株。 結(jié)果 1 .PCR分析、酶切鑒定及其DNA序列分析證實(shí)CTB基因已經(jīng)以正確方向插入到載體P13W4中， 而且所克隆的基因與報(bào)道的相應(yīng)核昔酸序列同源性為100%;NOS終止子、CTB~ureB融合基因和W卜 。K融合片段也以正確方向、相應(yīng)的次序插入到載體pCAMBIA1300中，CTB一ureB融合基因讀碼框 正確，將其與GenBank中公布的相應(yīng)基因序列比較，CTB基因序列的同源性為100%，推定氨基酸序 列同源性也為100%。講eB基因序列同源性為%.0%一97.7%，氨基酸的同源性為98.8%一99.5%。 2.PcR分析、酶切鑒定證實(shí)水稻表達(dá)載體P13W4一cTB和pCWUN分別成功轉(zhuǎn)化感受態(tài)根瘤土壤 桿菌。 3.PCR分析證實(shí)水稻幼苗的染色體DNA中已經(jīng)整合了CTB基因。 結(jié)論 1.成功構(gòu)建了水稻表達(dá)載體pl3W4一CTB和pWCUN，并經(jīng)序列分析證實(shí)序列無(wú)誤。 2.水稻表達(dá)載體p13w4一CTB和pwcUN成功轉(zhuǎn)化根瘤土壤桿菌。 3.根瘤土壤桿菌成功介導(dǎo)p13W4一CTB轉(zhuǎn)化水稻，獲得轉(zhuǎn)基因植株。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2779272