【摘要】： 目的：在成功的建立體外大鼠破骨細胞培養(yǎng)系的基礎(chǔ)上觀察不同濃度的阿侖磷酸鹽在體外實驗中誘導破骨細胞凋亡的情況，并通過體內(nèi)實驗加以論證。 方法：實驗分兩組：體外實驗組(細胞培養(yǎng)組)；體內(nèi)實驗組(動物實驗組)。 體外實驗。全骨髓細胞的提取及培養(yǎng)：將4周齡雄性SD大鼠乙醚麻醉，斷頸處死。無菌條件下取股骨和脛骨，去凈骨表面的軟組織，剪斷長骨兩骺端，暴露骨髓腔，用10ml一次性注射器吸取10miα-MEM插入髓腔沖洗，至骨發(fā)白。收集細胞懸液，然后以1500轉(zhuǎn)／分鐘離心4分鐘，棄去上清液，再加入40mlα-MEM吹打均勻后進行二次離心。這樣洗滌細胞兩次后，加入20mlα-MEM全培養(yǎng)液(體積分數(shù)15％新生牛血清，青霉素1000μ／ml，鏈霉素1000μg／ml)，計算細胞數(shù)，配成2×10~6cell／ml的細胞懸液，注入24孔培養(yǎng)板0.5ml／孔和50ml培養(yǎng)瓶10ml／瓶，同時加入1,25(OH)_2D_3使其終濃度為10~(-8)mol／l，然后放入5％CO_237℃孵育箱中培養(yǎng)。每3天更換一次培養(yǎng)液，去掉3／5體積的舊培養(yǎng)液，換以同體積的含1,25(OH)_2D_3新培養(yǎng)液。培養(yǎng)至第六天時，經(jīng)倒置相差顯微鏡和TRAP特異染色證實所培養(yǎng)的細胞為破骨細胞。 培養(yǎng)板組和對照組：培養(yǎng)至第6天，加入ALN，使其終濃度為10~(-8)，10~(-7)，10~(-6)，10~(-5)M，對照組給予同體積的 中文摘要 磷酸緩沖液①BS），繼續(xù)培養(yǎng)48小時。然后，平板離心 4分鐘，1500轉(zhuǎn)／分鐘，TRAP染色，鏡下計數(shù)每孔的破骨 細胞數(shù)目。再滴加 Hoechest33258染液，濃度為 5 u g／tl， 室溫下避光放置15分鐘，PBS緩沖液沖洗干凈，并用濾 紙吸干液體，倒置熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡的形態(tài)和數(shù) 目。 培養(yǎng)瓶組和對照組：同上，培養(yǎng)至第6天時，加入同 板中濃度一致的ALN和同體積的PBS緩沖液，培養(yǎng)48 小時后，細胞刷輕刮瓶壁，洗滌兩次，送流式細胞儀檢測。 用 Annexin－V和 PI結(jié)合檢測凋亡的破骨細胞數(shù)目。 體內(nèi)實驗。給藥：將3只大鼠隨機分成用藥組閃根 骨）和陰性對照組N根骨），按 Zing／kg ＃J量腹腔內(nèi)注射 ALN和 PBS連續(xù) 2日。 灌流固定及取骨：最后一次給藥24小時后，2％戊巴 比妥鈉腹腔內(nèi)注射，每只鼠注射0．4心石ml，36分鐘后， 待大鼠全身癱軟，進入麻醉狀態(tài)，將其四肢固定，剪開胸 部皮膚及皮下組織，暴露心臟，用12號針從左心室直插 入主動脈，同時剪開左心耳，進行心臟灌流。先以PBS 液將全身的血液沖出，然后注入固定液門．25％戊二醛，4％ 多聚甲醛，0．IM PBS液＊ 待大鼠全身僵直后，停止灌流。 按體外實驗的方法取其股骨和腔骨，然后放入固定液中， 浸潤固定2上小時。 脫鈣：將固定好的骨標本用0．IM PBS液沖洗干凈，放 入PBS液中4oC冰箱過夜。第二日，將骨標本放入PH＝7．4 的 5OEDM（ethylenediaminotetra acetic acid）中脫鈣 2周， 隔日換液一次。 2 中文摘要 制作骨切片：將脫好鈣的骨標本常規(guī)梯度脫水，二甲 苯透明，浸蠟，包埋，然后將蠟塊切成spin厚的組織切 片備用。 TRAP染色：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水。在常溫下，將 配好的htP染色液滴于切片上，每張3滴左右，然后放 入 5％COZ 37oC孵育箱孵育，30分鐘后取出，用蒸餾水沖 洗干凈。 蘇木素復染：將TRAP染好的切片放入蘇木素中5分 鐘，鹽酸－酒精分化后，二次脫水，二甲苯透明，樹膠封 片。 結(jié)果：l、體外實驗結(jié)果。IRAP染色結(jié)果：培養(yǎng)第 六天1’’vin染色，胞漿呈紫紅色且伸出許多細長的偽足樣 突起，細胞核多者為破骨細胞。加藥后，對照組的陽性細 胞數(shù)目明顯多于用藥組，且胞漿豐滿，內(nèi)含許多空泡結(jié)構(gòu)， 核仁清晰，核呈圓形或橢圓形，體積較大。而用藥組不僅 細胞數(shù)目少，且細胞多胞漿皺縮，TRAP染色極深，核固 縮，核仁結(jié)構(gòu)不清晰，但與正常的破骨細胞的體積大小近 似。這種形態(tài)學特征就是凋亡。相比較而言，二者在形態(tài) 上還是很好區(qū)分出來的。同時，用藥組與對照組均未見到 死亡的破骨細胞。 計數(shù)各組的破骨細胞數(shù)，對照組的細胞數(shù)為203．63土 2．92，明顯多于各用藥組（155．50士2．69，fis．50士2．29，93．88 土1．92，79．88土232），p＜0刀1有顯著性差異。且各用藥組間 除 10”’M和 10－’M之間無顯著性差異外，均有顯著性差異， 表明破骨細胞數(shù)目隨ALN的濃度增加而減少，兩者有劑 量依賴性。 3 中文摘要 Hoechest 33258熒光染色結(jié)果：Hoechest 33258是一 種活細胞染料，將顯微鏡調(diào)至WU段，在TRAP染色的 背景映襯
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2002
【分類號】：R361

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉慧;許兵;程婉;姜月艷;;不同濃度右歸飲對OC形成分化的影響[J];內(nèi)蒙古中醫(yī)藥;2011年16期

2 王嘯嘯;朱亦X;史書紅;郗光霞;李興;郭志新;劉素筠;趙寶珍;;核因子κB受體活化因子在破骨細胞培養(yǎng)中表達時相的研究[J];山西醫(yī)科大學學報;2011年09期

3 史冊;孫宏晨;李琛;陳彥澤;;腺病毒介導TWEAK基因?qū)ζ乒羌毎绊懙捏w外研究[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2011年04期

4 王立;戚孟春;劉彩霞;董偉;;阿侖膦酸鈉對破骨細胞分化中c-fos基因表達的影響[J];醫(yī)學研究雜志;2011年07期

5 張文娟;林雪芬;艾白媛;張君;;丹參對正畸牙模型大鼠牙槽骨重塑的影響[J];山東中醫(yī)雜志;2011年08期

6 余文超;劉巖;袁文;郭永飛;曹振羽;鄒翰林;;脊髓損傷早期及制動后大鼠股骨遠端組織形態(tài)學觀察[J];創(chuàng)傷外科雜志;2011年05期

7 李寶新;李玉坤;;FGFs/FGFRs系統(tǒng)對骨調(diào)節(jié)的研究進展[J];中國細胞生物學學報;2011年03期

8 呂浩然;黃彥;楊進順;胡海瀾;;骨質(zhì)疏松患者股骨頸骨折人工股骨頭置換術(shù)后不同治療方法的比較[J];臨床醫(yī)學工程;2011年06期

9 張本貴;吳江;郭應強;陳槐卿;;鈦顆粒負荷下成骨細胞對破骨細胞功能的調(diào)節(jié)作用[J];生物醫(yī)學工程學雜志;2011年03期

10 房思思;張麗萍;劉璐;;氟的生物學作用——氟對骨的作用[J];微量元素與健康研究;2011年04期

相關(guān)會議論文 前10條

1 韓大慶;張其清;;破骨細胞完善類骨組織體外重建的研究[A];天津市生物醫(yī)學工程學會2006年學術(shù)年會論文摘要集[C];2006年

2 戴閩;程明;劉虎誠;程細高;范紅先;張斌;;不同濃度金屬磨損顆粒對破骨細胞體外分化的影響[A];第十九屆中國康協(xié)肢殘康復學術(shù)年會論文選集[C];2010年

3 童培建;肖魯偉;沈龍祥;杜文喜;厲駒;潘杰;;RNA干擾靶向Atp6i基因抑制破骨細胞骨吸收的實驗研究[A];2006年浙江省骨科學術(shù)會議暨浙江省脊柱脊髓學術(shù)會議論文匯編[C];2006年

4 尹文哲;陶天遵;陶樹清;;大鼠成骨細胞與破骨細胞共育的實驗研究[A];第二屆海峽兩岸矯形外科學術(shù)研討會論文集[C];2004年

5 張小超;董澤軍;閆鴻麗;劉吉開;何波;沈志強;;老鸛草素對破骨細胞體外骨吸收功能和Ⅱ型碳酸酐酶表達的影響[A];中國藥學會應用藥理專業(yè)委員會第三屆學術(shù)會議、中國藥理學會制藥工業(yè)專業(yè)委員會第十三屆學術(shù)會議暨2008生物醫(yī)藥學術(shù)論壇論文匯編[C];2008年

6 錢成;陶天遵;吳瑩;李曉蕊;陶樹清;柳樹清;劉楓晨;吳麗萍;柳海峰;;中藥Liu-OGN對大鼠破骨細胞體外培養(yǎng)的影響[A];第五次全國創(chuàng)傷康復暨第七次全國運動療法學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

7 葉勝難;;破骨細胞在中耳膽脂瘤骨質(zhì)破壞中的作用[A];華東六省一市耳鼻咽喉-頭頸外科學術(shù)會議暨2008年浙江省耳鼻咽喉-頭頸外科學術(shù)年會論文匯編[C];2008年

8 田宗成;狄升蒙;高翔;騫愛榮;商澎;;失重條件下破骨細胞研究[A];中國空間科學學會第七次學術(shù)年會會議手冊及文集[C];2009年

9 吳承亮;李陶冶;吳俊生;金紅婷;童培建;;右歸飲對體外培養(yǎng)破骨細胞分化和功能的影響[A];2009年浙江省風濕病學學術(shù)會議論文匯編[C];2009年

10 張忠民;陳建庭;金大地;武大林;陳祥捚;;血小板衍生生長因子-AA對破骨細胞功能的影響[A];全國老年骨質(zhì)疏松專題學術(shù)研討會論文匯編[C];2000年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 王小龍;科學家發(fā)現(xiàn)破骨細胞抑制劑[N];科技日報;2009年

2 鮑捷;抑制破骨細胞 讓骨質(zhì)疏松剎車[N];健康報;2003年

3 錢錚;“W9肽”可抑制破骨細胞生成[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2006年

4 錢錚;日本發(fā)現(xiàn)抑制破骨細胞作用的物質(zhì)[N];中國勞動保障報;2006年

5 小新;日發(fā)現(xiàn)雌激素可抑制破骨細胞作用[N];中國醫(yī)藥報;2007年

6 ;雌激素可抑制破骨細胞作用[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2007年

7 本報特約記者 吳遠團;“林黛玉”要及早防駝背[N];健康時報;2005年

8 范思立;補鈣亟需開創(chuàng)新領(lǐng)域[N];中國經(jīng)濟時報;2007年

9 香港麥迪信醫(yī)學出版有限公司供稿;多因素影響骨代謝平衡[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

10 盧蘇燕;法專家治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移獲進展[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2007年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 吳宗鍵;阿倫磷酸納預防人工關(guān)節(jié)無菌松動實驗研究[D];軍醫(yī)進修學院;2001年

2 朱保民;流體剪切力對破骨細胞降鈣素受體（CTR）及整合素αVβ3 mRNA表達影響的研究[D];四川大學;2005年

3 魯秀敏;FGFR1對破骨細胞分化成熟與骨吸收功能的調(diào)控作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2008年

4 童水龍;人破骨細胞刺激因子的結(jié)構(gòu)生物學研究及普通變形桿菌的LAD初步晶體學研究[D];中國科學技術(shù)大學;2008年

5 白生賓;氟對破骨細胞增殖的影響及可能的分子機制[D];中南大學;2012年

6 李平;流體剪切力作用下破骨細胞的鈣響應特征及機制[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2012年

7 朱恒;間充質(zhì)干細胞調(diào)節(jié)破骨細胞發(fā)育和功能的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院;2010年

8 曹亞飛;中藥骨康對破骨細胞活性及凋亡的影響[D];廣州中醫(yī)藥大學;2002年

9 王峰;正畸牙周組織改建中破骨細胞分化因子和發(fā)生抑制因子表達的研究[D];第四軍醫(yī)大學;2004年

10 李會杰;Ⅰ型神經(jīng)纖維瘤病基因型小鼠破骨細胞功能及其與骨橋蛋白相關(guān)性實驗研究[D];河北醫(yī)科大學;2009年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 高明津;阿侖磷酸鹽誘導破骨細胞凋亡的實驗研究[D];河北醫(yī)科大學;2002年

2 陳雁南;局部應用OPG對鼠正畸牙移動影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學;2008年

3 龍麗;氟化鈉對體外培養(yǎng)骨細胞影響的研究[D];新疆醫(yī)科大學;2003年

4 陳建明;重組人骨形成蛋白-2對破骨樣細胞形成的影響[D];福建醫(yī)科大學;2008年

5 張麗娜;糖皮質(zhì)激素與骨質(zhì)疏松癥[D];河北醫(yī)科大學;2008年

6 彭菊香;rhIGF-1對大鼠正畸牙移動過程中破骨細胞數(shù)量及其c-Src表達的影響[D];遵義醫(yī)學院;2009年

7 張建華;破骨細胞在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的作用[D];蘇州大學;2006年

8 沈龍祥;RNA干擾靶向atp6i基因抑制破骨細胞骨吸收的實驗研究[D];浙江中醫(yī)藥大學;2006年

9 劉應芬;流體剪應力對去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠破骨細胞骨吸收功能的影響[D];四川大學;2007年

10 孫繼芾;破骨細胞培養(yǎng)體系的建立及紅霉素對破骨細胞骨吸收作用的影響[D];南京醫(yī)科大學;2008年

本文編號：2745716