本文關(guān)鍵詞：腸炎沙門菌和雛沙門菌fimH基因缺失株的構(gòu)建及相關(guān)功能性分析，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：腸炎沙門菌是一種重要的人畜共患病病原菌,具有廣泛的宿主譜,能引起人和動物腸道或全身性疾病。雛沙門菌屬于專嗜性病原菌,可引起不同日齡的雞感染發(fā)病,耐受雞長期帶菌且生長發(fā)育遲緩,給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失,同時也嚴重威脅人和動物的健康。沙門菌屬經(jīng)口感染宿主,然后通過對腸上皮細胞或位于派氏結(jié)淋巴組織的侵襲,將感染的吞噬細胞移動到淋巴細胞,細菌在此開始繁殖。在此過程中,沙門菌對宿主細胞的黏附是引起宿主致病的先決條件。鑒于FimH的功能研究大多集中在尿道致病性大腸桿菌(Uropathogenic Escherichia coli, UPEC)對尿道表皮細胞的黏附方面,而對腸炎沙門菌和雛沙門菌致病進程中FimH所參與的生物學功能卻鮮有報道。本研究以I型菌毛fimH基因為切入點,探究其在腸炎沙門菌和雛沙門菌中所發(fā)揮的生物學功能。通過構(gòu)建腸炎沙門菌I型菌毛主要亞單位FimA原核表達載體,并制備鼠源多克隆抗體,利用Western-Blot驗證腸炎沙門菌和雛沙門菌I型菌毛的表達。本研究通過比對GenBank上沙門菌I型菌毛fimH基因序列,設(shè)計一對PCR引物擴增腸炎沙門菌CMCC(B)50336和雛沙門菌15218 Ⅰ型菌毛的fimH基因序列,根據(jù)PCR測序結(jié)果設(shè)計一對同源重組引物,其5’端與fimH基因序列兩側(cè)同源,而3’端與氯霉素抗性基因cat表達盒同源。利用λ噬菌體-Red同源重組系統(tǒng)對腸炎沙門菌標準株CMCC(B)50336和雛沙門菌標準株15218的fimH基因進行敲除。首先,以質(zhì)粒pKD3為模板擴增含有氯霉素抗性的PCR產(chǎn)物,經(jīng)純化后分別電轉(zhuǎn)化至含質(zhì)粒pKD46的腸炎沙門菌CMCC(B)50336和雛沙門菌15218中,在Red同源重組酶Exo、Beta、Gam的作用下,含有氯霉素抗性基因片段的產(chǎn)物借助兩翼同源序列與染色體上的靶基因發(fā)生重組,置換fimH基因,分別獲得一次重組菌50336 △fimH::cat和15218△fimH::cat。在二次重組中,將編碼FLP重組酶的質(zhì)粒pCP20分別電轉(zhuǎn)化入50336△fimH::cat、15218△fimH::cat突變株中,通過對cat閱讀框兩側(cè)的FLP位點的識別,從而消除氯霉素抗性基因。最后通過PCR檢測和DNA測序結(jié)果,驗證缺失株50336△fimH和15218△ fimH成功構(gòu)建。血凝試驗和酵母凝集試驗表明,腸炎沙門菌能發(fā)生明顯的凝集現(xiàn)象,而fimH缺失突變株喪失凝集能力。生物被膜定性和定量試驗證明FimH促進腸炎沙門菌生物被膜的形成。此外,在腸炎沙門菌中,FimH促進對禽巨噬細胞HD-11的黏附。然而,雛沙門菌既不能與紅細胞和酵母細胞發(fā)生凝集反應(yīng),也不能對禽巨噬細胞進行黏附。Real-Time PCR試驗結(jié)果顯示,fimH缺失上調(diào)了卷曲菌毛主要調(diào)節(jié)子csgD和外膜蛋白ompD的轉(zhuǎn)錄。綜上所述,腸炎沙門菌Ⅰ型菌毛FimH參與對紅細胞凝集、生物被膜的形成以及在禽巨噬細胞的黏附方面發(fā)揮重要作用,而雛沙門菌Ⅰ型菌毛FimH則喪失了對紅細胞凝集、生物被膜的形成以及對禽巨噬細胞的黏附能力。
【關(guān)鍵詞】：腸炎沙門菌 雛沙門菌 Ⅰ型菌毛 fimA基因 fimH基因 生物被膜 黏附
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.61;R378
【目錄】：

• 中文摘要3-4
• Abstract4-11
• 符號說明11-12
• 沙門菌的毒力因子與致病機理12-27
• 1 沙門菌屬12
• 2 沙門菌屬的分類12
• 3 沙門菌的微生物學診斷12-13
• 4 沙門菌屬的致病機理13-14
• 5 沙門菌的毒力因子14-16
• 5.1 沙門菌毒力島(Salmonella pathogenicity islands,SPIs)14-15
• 5.2 pSLT質(zhì)粒15
• 5.3 黏附素15-16
• 5.4 鞭毛和趨化性16
• 5.5 生物被膜與慢性感染16
• 6 總結(jié)與展望16-17
• 參考文獻17-27
• 研究一：腸炎沙門菌和雛沙門菌fimH缺失株的構(gòu)建27-42
• 1 材料29-30
• 1.1 菌株與質(zhì)粒29-30
• 1.2 培養(yǎng)基和主要試劑30
• 1.3 主要儀器30
• 2 方法30-35
• 2.1 fim H基因缺失引物設(shè)計30
• 2.2 氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物的制備和純化30-31
• 2.3 腸炎沙門菌和雛沙門菌感受態(tài)細胞的制備和質(zhì)粒pKD46的轉(zhuǎn)化31-32
• 2.4 Red同源重組酶的誘導(dǎo)和感受態(tài)細胞制備32
• 2.5 含同源臂的氯霉素抗性基因PCR產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化32-33
• 2.6 質(zhì)粒pKD46的消除33
• 2.7 第一次同源重組菌50336ΔfimH：：cat和15218ΔfimH.::cat的PCR鑒定33-34
• 2.8 FLP位點專一性重組34
• 2.9 第二次同源重組菌的鑒定34-35
• 3 結(jié)果35-39
• 3.1 腸炎沙門菌與雛沙門菌fimH測序結(jié)果分析35-36
• 3.2 融合PCR產(chǎn)物的制備36-37
• 3.4 第二次重組菌50336ΔfimH和15218ΔfimH的PCR鑒定37-38
• 3.5 fimH基因缺失株的序列分析38-39
• 4 討論39
• 參考文獻39-42
• 研究二：腸炎沙門菌Ⅰ型菌毛主要亞單位FimA表達純化及多克隆抗體的制備42-54
• 1 材料43-44
• 1.1 菌株、質(zhì)粒43
• 1.2 實驗動物43
• 1.3 培養(yǎng)基和主要試劑43
• 1.4 主要儀器43-44
• 2 方法44-46
• 2.1 引物設(shè)計與合成44
• 2.2 PCR模板的制備44
• 2.3 目的基因fimA PCR擴增體系與程序44
• 2.4 目的基因fimA的克隆與鑒定44
• 2.5 pET-28α(+)-fimA重組表達載體的構(gòu)建44-45
• 2.6 FimA重組蛋白的表達和純化45-46
• 3 結(jié)果與分析46-51
• 3.1 fimA基因擴增產(chǎn)物的鑒定46-47
• 3.2 pET-28a(+)-挪重組表達質(zhì)粒的鑒定47-48
• 3.3 pET-28α(+)-fimA重組蛋白表達優(yōu)化48
• 3.4 FimA重組蛋白的表達形式分析和純化48-50
• 3.5 重組蛋白FimA Western-Blot鑒定50
• 3.6 FimA鼠源多克隆抗體的制備及鑒定50-51
• 4 討論51-52
• 參考文獻52-54
• 研究三：腸炎沙門菌和雛沙門菌Ⅰ型菌毛亞單位fimH基因缺失突變株的相關(guān)功能性分析、54-74
• 1 材料55-56
• 1.1 菌株、質(zhì)粒、細胞系55
• 1.2 主要試劑55-56
• 1.3 儀器設(shè)備56
• 1.4 試驗動物56
• 2 方法56-61
• 2.1 細菌生化鑒定56
• 2.2 細菌血清型鑒定試驗56
• 2.3 野生株以及fimH突變株生長試驗測定56-57
• 2.4 畢赤酵母凝集試驗和凝集抑制試驗57
• 2.5 血凝試驗(HA)和甘露糖敏感性血凝抑制試驗(MSHA)57
• 2.6 半固體運動性試驗57
• 2.7 生物被膜的定性試驗57-58
• 2.8 生物被膜定量試驗58
• 2.9 菌株耐藥性試驗58
• 2.10 HD-11細胞黏附試驗58-59
• 2.11 Real-Time PCR定量分析試驗59-61
• 3 結(jié)果61-69
• 3.1 細菌生化鑒定實驗61-62
• 3.2 細菌的血清型鑒定試驗62-63
• 3.3 生長曲線測定63
• 3.4 畢赤酵母凝集試驗和凝集抑制試驗63-64
• 3.5 血凝試驗(HA)和甘露糖敏感性血凝抑制試驗(MSHA)64-65
• 3.6 半固體運動性試驗65
• 3.7 生物被膜定性試驗65
• 3.8 生物被膜定量試驗65-66
• 3.9 菌株耐藥性試驗66
• 3.10 HD-11細胞黏附試驗66-67
• 3.11 Real-Time PCR定量分析試驗67-69
• 4 討論69-70
• 參考文獻70-74
• 全文小結(jié)74-75
• 致謝75-76
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學術(shù)論文76-77

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  本文關(guān)鍵詞：腸炎沙門菌和雛沙門菌fimH基因缺失株的構(gòu)建及相關(guān)功能性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：272971