【摘要】：目的 腺病毒AdEasy系統(tǒng)是一種利用原核細胞完成重組穿梭質粒與腺病毒骨架質粒之間的同源重組，快速構建重組腺病毒的好方法。我們將其中的某些步驟進行了改進，以獲得一種更加高效、簡便、快速構建重組腺病毒的方法。 方法 我們將腺病毒骨架載體pAdEasy-1通過電穿孔法轉化E．coli BJ5183感受態(tài)細胞，經(jīng)抗性篩選、酶切鑒定獲得含pAdEasy-1的E．coli BJ5183／p菌種，并鑒定其穩(wěn)定性。隨后用CaCl_2法制備E．coli BJ5183／p感受態(tài)細胞。并轉化含GFP的腺病毒穿梭質粒，利用E．coli BJ5183細胞內(nèi)同源重組機制獲得重組腺病毒質粒，經(jīng)酶切鑒定并確定重組的位置。與常規(guī)的共轉化方法相比較，了解這種方法的重組效率。將鑒定正確的重組腺病毒質粒進一步轉化E．coli DH10B感受態(tài)細胞，獲得高拷貝的重組質粒。以Pac Ⅰ酶切，，獲得重組腺病毒DNA分子，脂質體法轉染293細胞，產(chǎn)生基因組結構均一的重組腺病毒。感染原代血吸蟲細胞進行腺病毒嗜性的初步研究。 結果 利用改進的方法，獲得了具有高度穩(wěn)定性可重復使用的E．coli BJ5183／p菌種，經(jīng)CaCl_2法制備為感受態(tài)細胞后，可方便地用于轉化重組穿梭質粒，并獲得重組腺病毒質粒。與常規(guī)方法相比較，該法的重組效率有一定的提高。重組腺病毒質粒DNA分子轉染293細胞，可觀察到293細胞出現(xiàn)腫脹，圓縮等典型的細胞病 安徽醫(yī)科大學碩士學位論文 變(C PE)，熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)有大量綠色熒光。進一步感染原代血吸蟲細胞， 表明腺病毒對其有一定的嗜性。 結論改進后的方法構建重組腺病毒更加簡便，重組效率較原方法提高，可在國內(nèi) 普通的分子生物學和病毒學實驗室內(nèi)完成構建工作。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【共引文獻】

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本文編號：2701156