發(fā)布時(shí)間：2020-06-05 13:35

【摘要】：腎綜合征出血熱是一類(lèi)危害較大的新現(xiàn)病毒性疾病，漢坦病毒是它的病原體，在我國(guó)以漢灘型和漢城型為主，其代表毒株分別為Z10株和L99株。在病毒的基因組中S基因所編碼的核蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成病毒核衣殼的主要成分。核蛋白具有很強(qiáng)的抗原性及免疫原性，，高度保守，患者對(duì)核蛋白的抗體應(yīng)答不僅出現(xiàn)的早且滴度高。因此，核蛋白可以用作理想的診斷抗原。巴氏畢赤酵母(Pichia pastoris)表達(dá)系統(tǒng)是一種新型外源基因表達(dá)系統(tǒng)，兼有原核細(xì)胞良好的可操作性和真核系統(tǒng)的后加工，表達(dá)基因插入整合在染色體上更為穩(wěn)定，且發(fā)酵條件簡(jiǎn)單，適宜高密度培養(yǎng)，具高效表達(dá)的優(yōu)勢(shì)，易于純化，為其產(chǎn)業(yè)化提供極大方便。 本文分別從漢坦病毒漢灘型Z10株和漢城型L99株感染的Vero-E6細(xì)胞中提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)S基因片段，插入pGEM-T-Easy載體中，經(jīng)酶切鑒定及序列分析，證實(shí)了基因片段的正確插入。繼而，將重組質(zhì)粒pGEM-T-Easy-Z10-S和pGEM-T-Easy-L99-S中的外源片段插入畢赤酵母分泌表達(dá)載體pPICZα，經(jīng)酶切鑒定及核苷酸序列分析證實(shí)重組質(zhì)粒pPICZαA-Z10-S和pPICZαC-L99-S的讀碼框架正確，并經(jīng)3D—PASSM server軟件分析預(yù)測(cè)目的蛋白空間結(jié)構(gòu)無(wú)改變。重組質(zhì)粒經(jīng)SacI酶切線(xiàn)性化后導(dǎo)入畢赤酵母菌X-33進(jìn)行插入整合，PCR鑒定證實(shí)S基因已插入酵母菌的染色體中，分別命名為Z10-S／X-33株和L99-S／X-33株。重組菌株經(jīng)0.5％甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，培養(yǎng)液上清經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示其表達(dá)S基因目的蛋白分子量與預(yù)期結(jié)果相一致。此外，表達(dá)蛋白Dot Blot抗原性鑒定結(jié)果顯示可被腎綜合征出血熱患者的陽(yáng)性血清所識(shí)別。漢坦病毒S基因的克隆及其在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)，為其深入研究奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2698130