本文關(guān)鍵詞：人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白的優(yōu)化表達，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景人乳頭瘤病毒(HPV)感染引起子宮頸癌等多種人類腫瘤。HPV基因型眾多,且彼此間缺乏有效免疫交叉保護。國際上現(xiàn)有疫苗價格昂貴,目前在我國仍無疫苗可用。研究目的基于大腸桿菌和畢赤酵母表達系統(tǒng),探討不同策略對于優(yōu)化HPV L1蛋白表達的影響,為研發(fā)針對多型別HPV的低價、廣譜疫苗提供基礎(chǔ)。研究方法在大腸桿菌中,采用非融合與不同融合蛋白形式,不同基因型HPV HPV16、18和58)L1序列,以及同一型但不同基因序列特征(包括哺乳動物細胞表達優(yōu)化序列P16、野生型序列W16、及兩個不同版本酵母表達優(yōu)化序列M16和Y16)等策略,構(gòu)建不同的重組表達質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化不同遺傳背景宿主菌,在不同溫度下進行誘導(dǎo)表達。在畢赤酵母中,采用不同序列特征的基因(即M16、Y16、W16和P16)、通過pPink-HC和pPink-LC質(zhì)粒載體篩選高拷貝或低拷貝表達克隆、轉(zhuǎn)化不同蛋白酶缺陷遺傳背景宿主細胞、構(gòu)建N端GST融合或C端截斷形式基因,利用釀酒酵母α-因子信號肽引導(dǎo)分泌表達等多種策略,探討提高HPV16 L1表達的有效方法。研究工作分析了不同基因序列mRNA的密碼子特征、自由能以及GC含量,以SDS-PAGE及Western blot分析L1蛋白表達水平及可溶性,并以電鏡觀察病毒樣顆粒(Virus-like particles, VLPs)的裝配。研究結(jié)果在原核表達系統(tǒng),經(jīng)酵母偏愛密碼子優(yōu)化的HPV 16、18、58 L1蛋白在GST融合形式下獲得了高效的相似水平的表達；HPV 16 L1非融合或硫氧還蛋白融合未見明顯表達；在遺傳背景不同的宿主菌DH5 α與BL21中表達水平無明顯區(qū)別；37℃誘導(dǎo)的重組蛋白以包涵體形式存在,而20℃誘導(dǎo)下,部分蛋白以可溶性形式存在；不同序列特征的HPV 16 L1基因獲得了類似的表達水平。在畢赤酵母表達系統(tǒng)中,與野生序列相比,密碼子優(yōu)化顯著提高了HPV16 L1的表達水平；N端GST融合與α因子修飾以及C端截斷基因形式未明顯改變表達水平；值得注意的是,基于哺乳動物細胞密碼子優(yōu)化的基因序列P16,同樣獲得有效表達；此外,畢赤酵母密碼子優(yōu)化序列M16與Y16表達水平相當,但M16顯示了較好的可溶性和VLPs裝配能力,而Y16可溶性極差；序列分析表明Y16和M16有5個氨基酸的差異。研究結(jié)論在大腸桿菌中,融合蛋白及誘導(dǎo)表達溫度顯著影響L1蛋白表達與折疊,而密碼子偏愛等基因序列特征無明顯影響。在畢赤酵母中,密碼子優(yōu)化是改善異源基因表達的有效手段,但mRNA二級結(jié)構(gòu)可能隨之變化并發(fā)揮重要影響；宿主菌蛋白酶缺陷對HPV L1蛋白穩(wěn)定性具有顯著促進；少數(shù)氨基酸變異可造成L1蛋白顯著不同的可溶性及VLPs裝配效率。本研究為有效制備HPV L1 VLPs、研發(fā)多型別HPV疫苗提供了基礎(chǔ),同時也為異源基因的重組表達優(yōu)化提供了有益借鑒。
【關(guān)鍵詞】：大腸桿菌 畢赤酵母 密碼子優(yōu)化 表達 人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 第一章 前言10-16
• 1.1 人乳頭瘤病毒簡介10
• 1.2 HPV的一般情況及生活周期10
• 1.3 HPV感染的危害性10-11
• 1.4 病毒樣顆粒及VLP疫苗11
• 1.5 HPV預(yù)防性疫苗研究進展11-13
• 1.6 HPV疫苗制備常用表達系統(tǒng)13-15
• 1.6.1 原核表達系統(tǒng)13
• 1.6.2 酵母表達系統(tǒng)13-14
• 1.6.2.1 釀酒酵母表達系統(tǒng)13-14
• 1.6.2.2 畢赤酵母表達系統(tǒng)14
• 1.6.2.3 漢遜酵母表達系統(tǒng)14
• 1.6.3 昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)14-15
• 1.7 本課題主要研究內(nèi)容、目的及意義15-16
• 第二章 實驗材料與方法16-44
• 2.1 材料16-25
• 2.1.1 質(zhì)粒及菌株16
• 2.1.2 主要試劑16-18
• 2.1.3 主要儀器18
• 2.1.4 常用試劑配制18-25
• 2.2 實驗方法25-44
• 2.2.1 密碼子優(yōu)化人乳頭瘤病毒主要衣殼蛋白L1(HPV L1)在大腸桿菌中的表達25-33
• 2.2.1.1 引物設(shè)計與PCR擴增HPV L1目的基因25-28
• 2.2.1.2 HPV 16L1非融合及Trx融合表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建28-31
• 2.2.1.3 HPV L1 GST融合表達質(zhì)粒的構(gòu)建31-32
• 2.2.1.4 HPV L1融合蛋白37℃培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)表達32-33
• 2.2.1.5 表達產(chǎn)物的分析與鑒定33
• 2.2.2 不同密碼子優(yōu)化HPV16基因序列在畢赤酵母中的表達33-44
• 2.2.2.1 HPV16L1不同基因序列的分析33
• 2.2.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建33-35
• 2.2.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定35-40
• 2.2.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞40-41
• 2.2.2.5 HPV16L1在畢赤酵母中的表達41-42
• 2.2.2.6 表達產(chǎn)物的分析與鑒定42-43
• 2.2.2.7 HPV16L1重組蛋白和病毒樣顆粒(VLPs)的初步純化和電鏡觀察43-44
• 第三章 實驗結(jié)果44-66
• 3.1 HPVL1基因在原核表達系統(tǒng)中的構(gòu)建、表達與鑒定44-49
• 3.1.1 PCR產(chǎn)物及重組質(zhì)粒鑒定44
• 3.1.2 不同融合形式HPV16 L1蛋白的表達44-46
• 3.1.3 不同宿主菌對HPV L1-GST融合蛋白表達的影響46-47
• 3.1.4 基因的不同核苷酸序列特征對HPV16 L1表達的影響47-48
• 3.1.5 不同基因型HPVL1蛋白的GST融合表達48
• 3.1.6 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度對表達的融合蛋白可溶性的影響48-49
• 3.1.7 小結(jié)49
• 3.2 不同密碼子優(yōu)化HPV16L1基因序列在畢赤酵母中的構(gòu)建、表達與鑒定49-62
• 3.2.1 HPV16L1不同基因序列的分析49-52
• 3.2.2 PCR體外擴增HPV16 L1基因以及重組質(zhì)粒酶切鑒定52-56
• 3.2.2.1 PCR擴增HPV16L1基因結(jié)果52-53
• 3.2.2.2 PCR產(chǎn)物及載體的酶切和回收53-54
• 3.2.2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定54-56
• 3.2.3 不同密碼子優(yōu)化HPV16L1基因序列在畢赤酵母中的表達56-59
• 3.2.3.1 HPV16L1基因序列M16、Y16、P16、W16在pPink HC中的表達56
• 3.2.3.2 比較HPV16L1基因序列M16、Y16、P16、W16在pPink HC和pPinkLC中的表達56-59
• 3.2.4 不同蛋白酶缺陷、融合及截斷形式對HPV16L1基因在畢赤酵母中表達的影響59-60
• 3.2.4.1 HPV16L1重組質(zhì)粒Y16HC在pPink Strain1、2、3、4中的表達59-60
• 3.2.4.2 HPV16L1不同融合及截斷形式的表達60
• 3.2.5 HPV16L1不同基因序列表達產(chǎn)物的可溶性分析和病毒樣顆粒的組裝能力的對比60-62
• 3.2.6 小結(jié)62
• 3.3 討論62-66
• 展望66-68
• 參考文獻68-73
• 致謝73-74
• 作者簡歷74-76

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1 賴年鈺;喻W

本文編號：261496