【摘要】： 人類紅細胞的血紅蛋白是由α-珠蛋白基因簇編碼的兩條珠蛋白肽 鏈及β-珠蛋白基因簇編碼的兩條珠蛋白肽鏈組成的四聚體。α基因簇位 于16號染色體，含四個功能基因，依次為5’-ζ-α_1-α_2-θ-3’；β基因 簇位于11號染色體，含5’-ε-~Gγ-~Aγ-δ-β-3’五個功能基因。人類各珠 蛋白基因表達具有一定的時間性及空間性，對每一類基因，某一階段僅 表達一個或以一個基因表達為主。當某一基因發(fā)生突變，其轉錄效率， mRNA的穩(wěn)定性，及編碼功能等都可能不同程度地發(fā)生異常，并可能影 響同簇其它基因的表達。地中海貧血即是因珠蛋白基因異常而引起的一 種主要在兒童期起病的遺傳性溶血性貧血。人們根據(jù)突變珠蛋白基因的 不同而將其分為α-，β-，δβ-，及γδβ-地貧等四種類型。本病在地 中海沿岸，東南亞及我國的廣東，廣西，四川等地高發(fā)，對兒童健康影 響很大，目前尚無有效的治療手段。對突變基因，正常基因的研究，有 望為臨床治療疾病提供理論基礎。 近年來，隨著分子生物學的快速發(fā)展，人們在基因水平已對地中海 貧血的分子機制進行了深入而廣泛的研究。而基因工程技術的日漸完善， 亦為人們研究珠蛋白基因調控機制提供了有效的手段，這些均使人們日 益注重基因轉錄表達的研究。為此，一個行之有效的檢測珠蛋白基因轉 錄水平的方法迫切需要建立。 國外已往的研究，多采用RT-PCR法，亦有采用探針法對珠蛋白基 因轉錄水平進行定量。但每次僅局限于2-4種珠蛋白基因，在同時研究 各種類型地中海貧血甚至復合型地中海貧血的致病機制，及全面系統(tǒng)地 研究珠蛋白基因表達切換規(guī)律，研究基因調控機制等時，其應用即受到 限制。而國內在此領域的研究開展得不多。目前尚未見同時對七種珠蛋 白基因轉錄水平進行監(jiān)測的報道。 本研究的目的即是建立一個能同時對7種珠蛋白基因（α，β，~A γ，~Gγ，，δ，ε，ζ）轉錄水平進行定量的方法。由于探針定量法RNA需量 大，尤其對兒童不適宜，且RNA易降解，操作時條件要求高，因此我們 D 選用盯－pCR t作為定量方汪。D l 在外周血中含量高，尚含RNA，故被用于珠蛋白某因轉錄的研究中。在l D 本研冤中我們宜先對外周血網(wǎng)織紅細胞的分離方法進行了改良，配制出D D 一種可高產(chǎn)量分離網(wǎng)織紅細胞的細胞分離液，并將與常用的淋巴細胞分D l 離液相比較，證明效果好，產(chǎn)量高。我們又對細胞質 NA提取方法進行 l DJ嘆臣，經(jīng)勺并腑氰限肌活比牧，顯不廣重同，和盯少，且N＠叮捉臍D D 口＊A，尤耳適用于地窗等需同肘對其某因水平講行定體研究時。巾干同D D 族壞蚤曰基兇的問源性很局，在撥計引物時，除考慮W密碼于的兼D l 最終自行設計出 13條共七對引物，經(jīng)基因庫擬合，確證特異。且產(chǎn)物片 l D 段眾皮與狽朋陰一致。在硼定僅匝懷殺組成過程中，多次對＊才”濃度進D D 行調整，最終確定 17．5－20mM為適宜濃度。在 PCR參數(shù)選擇上，經(jīng)多次 D l＆索條件，當 94’C，50’C及 72’C各 lmin時，即可全部擴增出 7種產(chǎn)物，l D 優(yōu)化實驗條件時。將每個循環(huán)的退火時間縮短30s。。，延伸時間縮短D 120see，仍可得到特異的產(chǎn)物，但每次循環(huán)時間可節(jié)約 25分鐘。l D 利用新建的方法從臍血，正常嬰兒及成人外周血中分離網(wǎng)織紅細胞，D l 提＆ RNA后，進行 RT－PCR 顯示隨著年齡的增長，胚胎型珠蛋白基因 l Iy，。的相對量呈下降趨勢，表現(xiàn)為。Iy．mopA從臍血的 0．54，到 61 l 月時的 0．87，成人的 1刀5。a／。－mRNA自 1．42，1．76，到 2．36，符合已 l D 知基因表達切換規(guī)律，即在個體發(fā)牛發(fā)育過租中．琳胳型珠蛋R某田優(yōu)D l 無農(nóng)這，隨二漸被具他成人型基囚代督。且葉Y－mRNA的變化與HbF l 陰要化一欺。驗證了本方法的可信性。進一步又對7例地中海盆血患者l lgn＃ffi臼 iRNA作出相對定量，在兩例攜帶 Q．地貧 l＄因的患者中，l D 檢測到 g－mRNA RT－PCR產(chǎn)物，同時 a．mANA的 RT－pCR產(chǎn)物量明顯下 D D 降，符合缺失型突變的預期的致病機理。曠純合子較p’雙重雜合子的D Da川－mRNA低，而曠雜合子則比其純合子低．與預湖結訟一＠。以佑D D 外培養(yǎng)的淋巴細胞提取的RNA作空白對照，用RTPCR檢測珠番白某田D D 轉求水干，5份標本結果全陰，初步顯示此方法假陽性率低。D l 此足重萬法側步嘆用顯不，結果可靠，省時（較以前方法至少節(jié)約l l 三分之二時間），假陽性率低。l 1．4．l I 此定量方法除可在各種地中海貧血突變基因的致病機理及人類珠蛋 D 白基因表達切換規(guī)律的分析中應用外，尚可用于藥物調控珠蛋白基因表 D 達機理及珠蛋白基因表達調控機制等的實驗研究中。由于
【學位授予單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2000
【分類號】：R346

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本文編號：2600890