發(fā)布時間：2020-03-25 13:09

【摘要】：人胰島素(Human insulin)是人胰島β細(xì)胞分泌的一種蛋白類激素，目前的市場需求很大，而市售的胰島素多為動物胰島素。本研究就是探討人胰島素在動物乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的可行性。研究用高保貞Taq酶通過PCR方法從正常人的基因組DNA中擴(kuò)增出1182bp的人胰島素原基因，運(yùn)用TA克隆的方法將擴(kuò)增片段插入PGEM-T-easy載體中，在Genebank中全序列分析表明擴(kuò)增出的hINS與其中一個發(fā)表序列完全吻合，而與另外的一個發(fā)表序列同源性為99％，不同的堿基其中一處是位于內(nèi)含子，其它三處位于等位多變點(diǎn)，這種堿基的差別可能與取樣的人種有關(guān)。 為了進(jìn)一步驗(yàn)證擴(kuò)增出的hINS基因能否在蛋白質(zhì)水平上表達(dá)，用構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體制作轉(zhuǎn)基因小鼠，利用轉(zhuǎn)基因小鼠作為個體表達(dá)系統(tǒng)來檢測目標(biāo)蛋白表達(dá)量。用高保貞長Taq酶通過PCR方法擴(kuò)增出牛αS1-casein基因的6.4kb的5’端上游調(diào)控序列(包括第一外顯子，第一內(nèi)含子，第二外顯子起始翻譯密碼子前的部分和5’端上游約5kb非翻譯區(qū))和1.5kb的3’端(緊接αS1-casein最后一個外顯子下游的1.5kb非翻譯區(qū))，將它們按照止確的順序連接，然后把測序正確的hINS基因序列克隆進(jìn)αS1-casein基因的5’端和3’端之間，驗(yàn)證其為止方向插入。 構(gòu)建的乳腺特異性表達(dá)載體去除原核部分(αS1-casein基因調(diào)控序列+人胰島素原基因)，顯微注射小鼠受精卵雄原核，獲得29只G_0代小鼠，PCR檢測出其中8只為轉(zhuǎn)基因剛性小鼠。檢測出的PCR陽性小鼠剪取尾巴提取基因組DNA，Xhol酶切消化基因組DNA，電泳轉(zhuǎn)印，用從測序正確的質(zhì)粒中酶切純化出探針，進(jìn)行Southern-blot，結(jié)果其中1只小鼠Southern-blot檢測呈陽性。轉(zhuǎn)基因小鼠自然泌乳以后，收集到5只轉(zhuǎn)基因小鼠和2只陰性小鼠的乳汁，脫脂脫酸以后，在乳清中用放射免疫檢測方法檢測胰島素的表達(dá)量，結(jié)果其中兩只轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)量明顯高于其它小鼠，表達(dá)量達(dá)到250uIU／ml和376uIU／ml，進(jìn)一步的蛋白質(zhì)定性和活性檢測正在繼續(xù)進(jìn)行中。
【圖文】：

一人腆島索原基因克隆，，鑒定1.PCR反應(yīng)產(chǎn)物大小鑒定PCR反應(yīng)經(jīng)過條件摸索，在退火溫度為62℃時，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果擴(kuò)增出預(yù)計(jì)大小的l.Zkb大小的DNA條帶(見圖2-1)，凝膠電泳表明擴(kuò)增效果較好，無非特異性條帶出現(xiàn)。回收條帶，純化后，準(zhǔn)備連接用。2，重組質(zhì)粒的篩選及酶切鑒定將PGEM一Teasy載體和PCR產(chǎn)物連接重組質(zhì)粒用xhol酶切、消化，產(chǎn)物經(jīng)過0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析，篩選出含有人胰島素原基因的重組克隆。酶切產(chǎn)物的電泳(如圖2.2)表明，用Xhof酶切可以切出1.2kb的片段和3.Okb載體，證明所挑選的的克隆為正確的重組體

3.1牛asl一easein基因5’端和3’端UTR連接鑒定將牛aSI一easein基因5’端和3’端連接后重組的質(zhì)粒(PssT)經(jīng)Xho卜Sall酶切出現(xiàn)9.4+l.6kb證明發(fā)生重組，而用Notl酶切出現(xiàn)8.0+3.Okb條帶則證明為正方向插入(如圖2一7)。圖2一7PSST質(zhì)粒酶切鑒定電泳FigZ一7:TheeleetrophoresisfordigestionPSSTPlasmidbyrestrieten到meM:入一EeoT141digestMarkerl:PSST質(zhì)粒Xhol+Sall酶切出9.4+1.6kb條帶2:PSST質(zhì)粒Notl酶切出8.0+3.okb條帶3.2胰島素原基因(h俐S基因)插入到調(diào)控序列鑒定將調(diào)控序列與人胰島素原基因(hINS基因)連接重組質(zhì)粒用Xhol酶切出1.2kb條帶證明為目的基因插入，而用PvuH酶切如果切出2.9，2.55，4.7+2.Okb條帶就證明插入的方向正確。命名為Psl(如圖2一8，2一9)圖2一SFSI項(xiàng)權(quán)醉切電冰FigZ一8:TheeleetrophoresisPlasmidbyXholrestrictenZymeM:入一EeoT141digestMarkerl:PSI質(zhì)粒Xhol酶切出l.ZkbfordigestionPSI條帶圖2一9Psl質(zhì)粒酶切電泳FigZ一6:TheelectrophoresisfordigestionpSTPlasmidbyPuvllrestrietenZymeM:人一EeoT141digestMarkerl:PSI質(zhì)粒Puvll酶切出4.7+2.okb條帶
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：Q78

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 于桂鳳;人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達(dá)載體的構(gòu)建及在山羊乳腺上皮細(xì)胞系中的表達(dá)[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

2 李貴陽;增強(qiáng)子、絕緣子和β-乳球蛋白調(diào)控序列啟動功能基因在山羊乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)的影響[D];揚(yáng)州大學(xué);2007年

本文編號：2599946