本文關(guān)鍵詞：凍干血小板在深Ⅱ度燙傷大鼠模型中對(duì)創(chuàng)面愈合作用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景血小板是哺乳動(dòng)物血液中的有形成分之一,是從骨髓成熟的巨核細(xì)胞胞質(zhì)裂解脫落下來(lái)的具有生物活性的小塊胞質(zhì),體積小,無(wú)細(xì)胞核。血小板主要發(fā)揮凝血、止血以及修補(bǔ)破損血管的功能,臨床上血小板用于血小板數(shù)量減少或血小板功能障礙患者的救治。國(guó)際上通用的保存方式是在22±2℃條件下振蕩保存,保存時(shí)間最多不超過(guò)7天,我國(guó)的血站技術(shù)操作規(guī)程(2012版)規(guī)定血小板保存為22±2℃條件下振蕩保存5天。由于保存時(shí)間短,臨床需求量大,目前對(duì)血小板的持續(xù)供應(yīng)難以得到保證,戰(zhàn)爭(zhēng)、自然災(zāi)害和突發(fā)事件時(shí)的保障更加艱難。劉景漢等國(guó)內(nèi)學(xué)者們?cè)谘“逯屑尤肓死鋬霰Ｗo(hù)劑二甲基亞砜(DMSO)來(lái)延長(zhǎng)血小板濃縮液的保存時(shí)間,目前大約可延長(zhǎng)至1年。但DMSO具有一定毒性,FDA許可的DMSO濃度為0.2%,我們國(guó)內(nèi)目前使用DMSO濃度為5%,遠(yuǎn)期毒性仍無(wú)法估測(cè),國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程上沒(méi)有明確對(duì)其進(jìn)行描述。并且-80℃深低溫冰凍保存在戰(zhàn)爭(zhēng)或突發(fā)事件時(shí)也很難實(shí)現(xiàn)。在20世紀(jì)50年代,美軍通過(guò)在添加各種保護(hù)劑進(jìn)行預(yù)處理,來(lái)提高血小板的抗凍和抗干燥能力以實(shí)現(xiàn)對(duì)濃縮血小板的凍干保存,提出了凍干血小板(freeze dried platelets,FDP)的概念。FDP有常溫保存、體積小、質(zhì)量輕、便于長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)。創(chuàng)面是指正常皮膚組織在外界致傷因子如外科手術(shù)、外力、熱、電流、化學(xué)物質(zhì)、低溫以及機(jī)體內(nèi)在因素如局部血液供應(yīng)障礙等作用下所導(dǎo)致的損害。創(chuàng)面的愈合是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程,其過(guò)程包括了炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、結(jié)締組織形成、創(chuàng)面收縮和創(chuàng)面重塑等幾個(gè)階段。在整個(gè)過(guò)程中多種修復(fù)細(xì)胞、炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)的成份共同參與,并在機(jī)體的調(diào)控下呈現(xiàn)高度的有序性、完整性和網(wǎng)絡(luò)性。其中任何一個(gè)環(huán)節(jié)發(fā)生紊亂將直接影響創(chuàng)面愈合的進(jìn)程。20世紀(jì)90年代開(kāi)始,研究者發(fā)現(xiàn)血小板能釋放多種生物活性物質(zhì),其中包括多種生長(zhǎng)因子,繼而開(kāi)始研究血小板對(duì)創(chuàng)面愈合的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)血小板能釋放300多種生物活性物質(zhì)。這些生長(zhǎng)因子可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖與分化,增加膠原的合成能力,對(duì)促進(jìn)基質(zhì)合成、沉降及組織的形成都有著重要的作用,而且各種生長(zhǎng)因子之間有良好的協(xié)同作用,可明顯促進(jìn)創(chuàng)面愈合。由于最初研究的外科醫(yī)生將其稱(chēng)為富血小板血漿(platelet rich plasma, PRP),相關(guān)研究對(duì)其說(shuō)法沿用至今。PRP已經(jīng)廣泛應(yīng)用于創(chuàng)傷修復(fù)方面的研究,涉及如口腔頜面外科、眼科、整形、骨科、燒傷等多學(xué)科,甚至在基因工程、細(xì)胞培養(yǎng)組織工程、抗衰老方面也顯現(xiàn)出了獨(dú)特的作用,治療效果獲得國(guó)內(nèi)外學(xué)者的證實(shí)和充分肯定,PRP不但可以提高止血效果、縮短手術(shù)時(shí)間,還可以減輕手術(shù)后腫脹、促進(jìn)傷口愈合,對(duì)創(chuàng)傷修復(fù)和組織重建具有重要的價(jià)值。研究證明FDP在復(fù)水化后,恢復(fù)率可達(dá)60-70%,保留了許多新鮮血小板形態(tài)學(xué)和功能上的特性。凍干血小板是否能像新鮮血小板一樣用于對(duì)血液病患者的救治作用仍未知。研究發(fā)現(xiàn)復(fù)水化后的FDP在被激活后和PRP相似,均可釋放出多種生長(zhǎng)因子。那么FDP是否能首先應(yīng)用于創(chuàng)面愈合,我們因此提出我們的研究方案。臨床上常見(jiàn)的急性創(chuàng)面除手術(shù)切口、皮膚擦傷外,燙傷也是常見(jiàn)病多發(fā)病。臨床上采用抗生素和手術(shù)治療,雖有一定的療治療效果,但患者常常出現(xiàn)創(chuàng)面收斂慢、產(chǎn)生耐藥菌、肝腎功能損傷以及機(jī)體免疫功能降低等反應(yīng)：因此本課題希望通過(guò)建立SD大鼠深Ⅱ度燙傷模型,來(lái)探究FDP在燙傷創(chuàng)面愈合中的修復(fù)作用。目的將血小板濃縮液進(jìn)行凍干處理后制備成FDP,并將其應(yīng)用于大鼠深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面的愈合,觀(guān)察FDP使用后創(chuàng)面的愈合情況,以驗(yàn)證FDP外用治療燙傷的療效,為其進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法1、FDP的制備(1)PRP的制備采用無(wú)償獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的全血,按國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)合格后進(jìn)行血小板分離,1500×g離心10min分離出上層富含血小板血漿,再將此富含血小板血漿經(jīng)3000×g離心20min,分離出上層貧血小板血漿和下層富血小板血漿,用貧血小板血漿來(lái)調(diào)整后者血小板的濃度,直至計(jì)數(shù)為1000×109/L備用。(2)PRP的凍干處理預(yù)處理液的配制：采用NaCl、KCl、CaCl2 MgSO4、NaHCO3、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸鈉、葡萄糖、超純水、海藻糖及可逆性血小板激活抑制劑,調(diào)PH為6.6-6.8,0.22μm濾器過(guò)濾；凍干緩沖液的配制：血小板預(yù)處理液中加入總體積30%的同型血漿,調(diào)PH為6.6-6.8,0.22μtm濾器過(guò)濾后備用。血小板1500×g離心15min,棄去上清,保留下層血小板沉淀物,用與棄去上清相同體積的預(yù)處理液重懸血小板,37℃水浴振蕩4h,使血小板保持懸浮狀態(tài)。4h水浴后,將血小板懸液再以1500×g離心15min,棄去上清,保留下層血小板沉淀物,用與棄去上清相同體積的凍干緩沖液重懸血小板。將預(yù)處理后血小板懸液轉(zhuǎn)移到硅化玻璃瓶中,每瓶4m1,置于-80℃超低溫冰箱中冷凍過(guò)夜,次日將凍干機(jī)打開(kāi)并使溫度降至-45℃后,再將樣品從-80℃超低溫冰箱取出,轉(zhuǎn)入凍干機(jī)進(jìn)行真空干燥,冷阱溫度為-45±5℃,真空度133mbar,24h后取出,并將其密封后保存于室溫。(3)凍干血小板復(fù)水化檢測(cè)室溫下保存1d以上的樣品將其復(fù)水化,復(fù)水化液為貧血小板血漿(platelet-poor plasma, PPP):無(wú)菌水=3：1(v/v),加入4ml復(fù)水化液后的樣品,輕輕振蕩至完全溶解,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀分別測(cè)定凍干前及復(fù)水化后血小板計(jì)數(shù)和平均血小板體積(nean platelet volume, MPV),并計(jì)算血小板回收率與MPV凍干前后差值；檢測(cè)血小板凍干前及凍干后d0、d10、d30生長(zhǎng)因子VEGF、TGF-β、PDGF-BB的釋放含量。2、SD大鼠深Ⅱ度燙傷模型的建立及FDP用于創(chuàng)面治療的效果研究將40只大鼠背部脫毛,脫毛面積4cm×6cm左右,用清水洗凈,觀(guān)察24h,確定脫毛部位皮膚無(wú)紅腫、炎癥和破損等異常情況。次日,SD大鼠禁食8h以上,用10%水合氯醛腹腔注射進(jìn)行麻醉,劑量為300mg/kg,麻醉生效后將大鼠固定于操作臺(tái),75%酒精消毒備皮區(qū)域。將不銹鋼鍋盛水置于電磁爐上,并將50g的砝碼置于鍋內(nèi)加熱至沸騰,持續(xù)5mmin。用止血鉗夾住砝碼上端立即置于大鼠脊柱兩側(cè)備皮區(qū),稍加壓力,維持15s,即可形成半徑為1cm的圓形深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面；根據(jù)臨床燒傷處理常規(guī),3h后行削痂術(shù),直至創(chuàng)面由蒼白變?yōu)榧t潤(rùn)為止。將造模成功的40只大鼠隨機(jī)分成四組,再根據(jù)組別進(jìn)行上藥。FDP組：將每瓶?jī)龈裳“逵?mL同型血漿復(fù)溶,與葡萄糖酸鈣以10：1的比例混合進(jìn)行激活后,噴灑于無(wú)菌紗布上,制備成血小板凝膠紗布(1mL/創(chuàng)面),無(wú)菌紗布包扎；PRP組：調(diào)整血小板濃度為1000×109/L,,其他操作步驟同F(xiàn)DP組；燙傷膏組：無(wú)菌棉簽直接涂抹后,無(wú)菌紗布包扎；空白組：僅用無(wú)菌紗布浸濕生理鹽水包扎。換藥時(shí)間分別為d1、d3、d5、d7、d9、d13、d19,換藥同時(shí)用透明坐標(biāo)紙覆蓋創(chuàng)面,沿創(chuàng)緣畫(huà)膜,計(jì)算創(chuàng)面面積,并每組隨機(jī)選取一個(gè)創(chuàng)面,取直徑約為1cm的創(chuàng)面組織用于組織學(xué)檢查(HE染色)。結(jié)果在血小板凍干效果評(píng)價(jià)中,凍干前后血小板數(shù)量和MPV存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)的差異,細(xì)胞回收率為87.24%；生長(zhǎng)因子VEGF、TGF-β和PDGF-BB釋放量隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)并未有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異,但PDGF-BB的含量在凍干前后有所差異(P0.05)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,不同處理組對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面愈合率的影響結(jié)果表明,在治療過(guò)程中,燙傷創(chuàng)面結(jié)痂面積逐步減小,愈合率顯著上升。在治療的d7,PRP組與FDP組均使大鼠燙傷創(chuàng)面面積明顯縮小,具有明顯的促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用,與實(shí)驗(yàn)對(duì)照組差異有顯著性(P0.05),而PRP組FDP組之間無(wú)明顯差異。提示FDP具有與PRP相近的促進(jìn)燙傷創(chuàng)面早期愈合的作用。不同處理組對(duì)大鼠燙傷創(chuàng)面病理組織學(xué)的影響。100倍鏡下觀(guān)察d1的組織標(biāo)本：皮膚損傷至真皮深層,細(xì)胞水腫,變性壞死,正常結(jié)構(gòu)消失,呈空洞狀,膠原纖維斷裂,已符合深Ⅱ度燙傷的判定標(biāo)準(zhǔn),提示造模成功；用藥d7:FDP組和PRP組表皮及真皮組織均有明顯的改善,皮膚創(chuàng)面的壞死組織及炎性滲出物顯著減少,毛細(xì)血管周?chē)性S多新生的成纖維細(xì)胞,可見(jiàn)大量肉芽組織形成,而燙傷膏組和空白組仍表現(xiàn)為表皮急性化膿性炎癥,細(xì)胞變性壞死,僅有少量肉芽組織形成；用藥d19:FDP組和PRP組表皮恢復(fù),可見(jiàn)少量毛囊和皮脂腺,細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)良好,真皮組織中的膠原纖維排列清晰,無(wú)溶解或雜亂現(xiàn)象,燙傷膏組和空白組仍有部分凝固性壞死和少量肉芽組織,未見(jiàn)毛囊和皮脂腺。結(jié)論血小板經(jīng)過(guò)凍干后,從血小板的外觀(guān)、回收率、MPV和凍干前后生長(zhǎng)因子含量及穩(wěn)定性等方面分析,本凍干方案基本可行,已滿(mǎn)足凍干和應(yīng)用要求,并且通過(guò)創(chuàng)面愈合率和組織病理學(xué)檢查證實(shí),FDP還具有與PRP相近的促進(jìn)燙傷創(chuàng)面愈合的作用。因此,本實(shí)驗(yàn)為臨床治療燙傷提供了一種可靠有效的救治方法,驗(yàn)證了FDP外用治療燙傷的功效,為FDP進(jìn)一步應(yīng)用于臨床提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。屬性不符
【關(guān)鍵詞】：富血小板血漿 凍干血小板 燙傷 創(chuàng)面愈合 動(dòng)物模型
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R644;R-332
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-16
• 前言16-22
• 第一章 凍干血小板凍干效果評(píng)價(jià)22-34
• 1.1 材料22-25
• 1.2 方法25-27
• 1.3 結(jié)果27-29
• 1.4 討論29-34
• 第二章 凍干血小板對(duì)燙傷創(chuàng)面的修復(fù)作用研究34-45
• 2.1 材料與方法35-36
• 2.2 大鼠背部燙傷模型制備36-38
• 2.3 結(jié)果38-41
• 2.4 討論41-45
• 綜述45-46
• 全文總結(jié)46-47
• 參考文獻(xiàn)47-56
• 中英文縮略詞表56-57
• 攻讀期間成果57-58
• 致謝58-59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 賀潤(rùn)明;張曉紅;張振錄;郭黛妮;;應(yīng)用解毒燒傷膏治療498例燒傷患者的臨床觀(guān)察[J];中國(guó)社區(qū)醫(yī)師;2006年10期

2 閻旭;何家才;周健;陳喬爾;劉彩霞;;富血小板血漿在口腔種植體周骨缺損中的應(yīng)用[J];安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2007年01期

3 任海濤;韓春茂;張嶸;徐志江;孟智啟;翁宏飚;牛寶龍;;抗菌肽天蠶素B對(duì)銅綠假單胞菌感染小鼠創(chuàng)面的抗菌作用[J];中華燒傷雜志;2006年06期

4 袁霆;張長(zhǎng)青;李四波;郭尚春;曾炳芳;;自體富血小板血漿與難愈合傷口的修復(fù)[J];中華整形外科雜志;2006年05期

  本文關(guān)鍵詞：凍干血小板在深Ⅱ度燙傷大鼠模型中對(duì)創(chuàng)面愈合作用研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：259054