【摘要】：第一部分 人糖代謝相關(guān)蛋白-1的蛋白表達(dá)與功能的初步研究 目的 克隆和表達(dá)人糖代謝相關(guān)蛋白-1(GMRP-1)基因，初步揭示GMRP-1的功能。 方法 RT-PCR克隆GMRP-1基因全長(zhǎng)，，將GMRP-1基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-32a與真核表達(dá)載體pEGFP—C3，在E.col ROSSET(DE3)菌中高效表達(dá)并純化GMRP-1融合蛋白，免疫新西蘭兔，制備多克隆抗體；利用共聚焦顯微鏡觀察GMRP-1在HEK293細(xì)胞中的定位。利用Northern Blot與Western Blot技術(shù)觀察了GMRP-1基因和蛋白表達(dá)譜，利用雙重免疫熒光組化和激光掃描共聚焦顯微鏡觀察GMRP-1在胰腺中的定位。同時(shí)利用Northern Blot與Western Blot技術(shù)觀察不同濃度葡萄糖不同作用時(shí)間對(duì)β-TC3細(xì)胞GMRP-1的基因和蛋白表達(dá)的影響。通過(guò)轉(zhuǎn)染和RNA干擾技術(shù)觀察GMRP-1與β-TC3細(xì)胞胰島素分泌的關(guān)系。結(jié)果 成功制備特異性好、效價(jià)較高的多克隆抗體。激光共聚焦顯微鏡顯示GMRP-1定位于HEK293細(xì)胞的細(xì)胞漿中。GMRP-1表達(dá)廣泛，其中在腦、骨骼肌、脂肪、肝臟、主動(dòng)脈、十二指腸及β細(xì)胞株β-TC3中表達(dá)較高。雙重免疫熒光組化和激光掃描共聚焦顯微鏡顯示GMRP-1定位在胰島中，在胰腺的外分泌腺中沒(méi)有表達(dá)，同時(shí)GMRP-1與胰島素有部分的重疊。葡萄糖對(duì)β-TC3細(xì)胞GMRP-1表達(dá)的影響呈劑量和時(shí)間依賴(lài)性關(guān)系，葡萄糖濃度增加，GMRP-1表達(dá)增加，20mmol／L濃度下表達(dá)最高。葡萄糖作用時(shí)間增加，GMRP-1表達(dá)增加，72小時(shí)表達(dá)最高。β-TC3細(xì)胞過(guò)表達(dá)GMRP-1及RNA干擾技術(shù)沉默β-TC3細(xì)胞GMRP-1表達(dá)后，胰島素分泌沒(méi)有明顯的差異。結(jié)論 GMRP-1特異性定位于大鼠胰島中，葡萄糖可以調(diào)控它在胰島β細(xì)胞中的表達(dá)，它在高糖導(dǎo)致的胰島β細(xì)胞功能變化中發(fā)揮重要的作用，它與β細(xì)胞胰島素分泌之間沒(méi)有直接的關(guān)系。 第二部分 人新型鈉鈣交換蛋白NCEx的蛋白表達(dá)與功能的初步研究 目的 克隆和表達(dá)人新型鈉鈣交換蛋白NCEx基因，初步揭示NCEx與糖尿病大血管并發(fā)癥的關(guān)系。方法 RT-PCR克隆NCEX基因全長(zhǎng)；將NCEX基因構(gòu)建到綠色熒光真核表達(dá)載體pEGFP—C3，利用共聚焦顯微鏡觀察NCEX在HEK293細(xì)胞與小鼠胰島素瘤β-TC3細(xì)胞中的定位。熒光分光光度儀觀察細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。Western印跡檢測(cè)NCEx在高血糖猴各組織與2型糖尿病主動(dòng)脈組織NCEX蛋白的差異表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)NCEX基因在人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMC)、人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HAEC)和人血管巨噬細(xì)胞(THP-1)細(xì)胞中的表達(dá)及不同葡萄糖濃度對(duì)其基因表達(dá)的影響，Northern blotting雜交驗(yàn)證高糖作用HAEC細(xì)胞NCEX mRNA的表達(dá)差異。結(jié)果 重組載體pGFP-C3—NCEX轉(zhuǎn)染后，定位于HEK293細(xì)胞與β-TC3細(xì)胞的細(xì)胞膜上。熒光分光光度儀觀察到NCEx過(guò)表達(dá)后HEK293細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯高于正常對(duì)照組，并有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)細(xì)胞外145 mmol／L的Na~+完全由145mmol／L的Li~+置換后，NCEx過(guò)表達(dá)的HEK293細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度出現(xiàn)大幅度的升高，在測(cè)定過(guò)程中加入終濃度為5mmol／L KCl時(shí)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化沒(méi)有影響。同時(shí)發(fā)現(xiàn)NCEx蛋白在高血糖猴與糖尿病患者主動(dòng)脈中表達(dá)上調(diào)，而在其他組織中無(wú)差異表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)NCEx主要表達(dá)在HAEC中，而HASMC和THP-1表達(dá)量低，RT-PCR和Northern Blotting結(jié)果顯示NCEx基因在血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)受到血糖的調(diào)控，作用72小時(shí)后，隨著D-葡萄糖濃度的升高，NCEx基因表達(dá)逐漸增加。結(jié)論NCEx的雙向轉(zhuǎn)運(yùn)模式主要以逆向轉(zhuǎn)運(yùn)模式即將細(xì)胞外Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞內(nèi)為主。NCEx在糖尿病大血管并發(fā)癥中發(fā)揮重要的作用。
【圖文】：

復(fù)旦大學(xué)博士研究生畢業(yè)論文已經(jīng)得到表達(dá)量較高的GMRP一1融合蛋白(見(jiàn)圖1一5)。同時(shí)通過(guò)超聲粉碎菌體后取上清和沉淀行SDS一PAGE電泳，顯示目的蛋白在沉淀即包涵體中表達(dá)，而上清中無(wú)表達(dá)(見(jiàn)圖1一6)。 234 234”6目~撇咤翻日，一，鷺娜嶸肇一

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