【摘要】：目的 本實(shí)驗(yàn)取SD大鼠睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞(progenitor Leydig cell,PLC)進(jìn)行體外分離、培養(yǎng)、鑒定,同時(shí)制作去勢(shì)大鼠模型,將經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)的PLC 移植入腎包膜內(nèi),采用HE 染色、酶組織化學(xué)染色、電鏡技術(shù)、MTT、RT-PCR 及磁分離均相酶聯(lián)免疫(磁酶免)睪酮定量測(cè)定法等技術(shù)方法觀察其在體內(nèi)外生長(zhǎng)分化情況,以期進(jìn)一步探討睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell,LC)生長(zhǎng)分化的機(jī)制,并為臨床應(yīng)用睪丸間質(zhì)細(xì)胞移植治療男性性腺功能低下癥提供實(shí)驗(yàn)參考。 方法 1 睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞的培養(yǎng) 取生后17~18 天的SD 乳大鼠,無(wú)菌操作下分離得到睪丸組織,0.1%膠原酶Ⅳ34℃消化,尼龍網(wǎng)過(guò)濾,收集消化所得細(xì)胞懸液,低速離心,細(xì)胞沉淀用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液重懸,接種于培養(yǎng)瓶中,采用差速貼壁法純化間質(zhì)細(xì)胞。 培養(yǎng)的乳大鼠睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞采用3β羥基甾醇脫氫酶(3β-hydroxysteroid dehydrogenase, 3β-HSD)組織化學(xué)染色法鑒定。常規(guī)HE 染色,通過(guò)光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);制作電鏡樣品,通過(guò)透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)特征。采用MTT法繪制生長(zhǎng)曲線,得出增殖活性最大的時(shí)間。應(yīng)用磁酶免方 法測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞分泌睪酮含量。 2 制作去勢(shì)大鼠模型并進(jìn)行細(xì)胞移植 取250g 重的SD 雄性大鼠30 只,手術(shù)切除雙側(cè)睪丸及附睪(去勢(shì))。將去勢(shì)后的SD 大鼠隨機(jī)分組(實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組)。用1ml 注射器向?qū)嶒?yàn)組大鼠腎包膜下各個(gè)方向依次均勻注射預(yù)先抽取好的移植細(xì)胞懸液0.1ml(約4~5×107 個(gè)細(xì)胞);對(duì)照組在相同部位注射0.1ml 的無(wú)血清培養(yǎng)液以代替移植細(xì)胞懸液。 3 測(cè)定移植細(xì)胞生長(zhǎng)狀況 通過(guò)磁酶免方法,測(cè)定大鼠體內(nèi)血清睪酮含量;采用RT-PCR 定量檢測(cè)促黃體生成素受體(luteinizing hormonereceptor, LHR)mRNA 表達(dá)狀況;記錄精囊的長(zhǎng)度和重量,精囊的重量按Boyle 介紹的公式計(jì)算相對(duì)重量=1 2兩側(cè)精囊重量(mg)×10 動(dòng)物體重(g)進(jìn)行結(jié)果觀察。 結(jié)果 1 分離細(xì)胞及純度鑒定 1.1 總的睪丸間質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞,經(jīng)過(guò)Ⅳ型膠原酶及機(jī)械法的作用,大部分間質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞都已經(jīng)消化下來(lái),而曲細(xì)精管保持完整,表面光滑,基本沒(méi)有斷裂。 1.2 培養(yǎng)24h 后,活性良好的睪丸間質(zhì)祖細(xì)胞大部分已貼壁,典型的呈梭形、三角形、多邊形,核大,部分細(xì)胞胞質(zhì)呈均勻的細(xì)顆粒狀,相差顯微鏡下可見(jiàn)為細(xì)小均一的脂滴。3β羥基甾醇脫氫酶(3β-HSD)染色陽(yáng)性率達(dá)68.2%以上。3~4 天后形成形態(tài)均一的細(xì)胞單層。此段時(shí)間細(xì)胞增殖旺盛,細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類(lèi)號(hào)】：R321

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2526065