【摘要】：目的: 研究細(xì)胞因子hTGF-β1對(duì)小鼠的淋巴細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,以及hTGF-β1基因修飾的大鼠軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能的改變,初步探討其作用機(jī)制。為尋找理想的軟骨組織工程種子細(xì)胞、并開(kāi)發(fā)新的異種移植排斥治療和預(yù)防方法奠定基礎(chǔ)。 方法: 將hTGF-β1細(xì)胞因子作用于小鼠淋巴細(xì)胞,利用熒光抗體標(biāo)記及Annexin V和7-AAD雙染色,結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)多克隆刺激劑作用下的淋巴細(xì)胞CD69及CD25表達(dá)水平及Annexin V~+/7-AAD~-細(xì)胞比例,判斷T細(xì)胞的活化與凋亡水平;~3H-TdR同位素?fù)饺敕z測(cè)淋巴細(xì)胞的增殖情況。另一方面,利用優(yōu)化的電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP-TGF-β1-N1表達(dá)載體導(dǎo)入大鼠原代培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞中,流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光表達(dá)率,熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)情況,同位素?fù)饺敕z測(cè)軟骨細(xì)胞生物學(xué)功能。 結(jié)果: 小同劑量hTGF-β1對(duì)于多克隆刺激劑作用的小鼠T細(xì)胞的活化較對(duì)照組均無(wú)明顯抑制作用;但可以抑制其增殖以及促進(jìn)活化誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞凋亡,并在一定范圍內(nèi)呈劑量依賴關(guān)系。流式細(xì)胞儀可以檢測(cè)到成功構(gòu)建的
【圖文】：

同時(shí)各刺激劑組相鄰實(shí)驗(yàn)組之間也有較明顯的差異(凡0.05):對(duì)于PDB+I。n刺激的淋巴細(xì)胞也觀察到幾乎一致的結(jié)果，差別在于該刺激組的中、低劑量?jī)山M之間未見(jiàn)差異(乃0.05)(表2一3、圖2一3);附圖2一2為一次實(shí)驗(yàn)的流式圖。表2一3與hTGF一pl共孵育的淋巴細(xì)胞在多克隆刺激劑作用下4Sh的凋亡情況Tab.2一3ApoPtosisoflymPhocyteseoculturedwithhTGF一plinresponsetoPolyelonalaetivationorf48hours(%，牙士s，n=6)stimulus(5林g/ml)hTGF一旦1(ng)PereentageofAnnexinv+/7一AAD(%)NoneConA0.30.03PDB+Ion0.30.037.00士1.2623.17士5.71a48.32士3.05網(wǎng)37.44士1.98be34.2士1.84b23，21士1.82a42.63士2.76e堆39.74士2.16e36.48士2.88ea尸<0.01vsNone，b尸<0.05vseo叭，“尸<0.05vseo叭+o.o3nghTor一pl，d作0.05vseo叭+0.3ng盯GF一p一，c尸<o.osv、PoB+一on

E.2.N.A.小量質(zhì)粒抽提試劑盒抽提質(zhì)粒，雙酶切鑒定陽(yáng)性克隆，并測(cè)序。(pEGFP一TGFpl一N1載體構(gòu)建示意圖及pEGFP一Nl多克隆位點(diǎn)見(jiàn)圖3一l)。軟骨細(xì)胞的分離與培養(yǎng)參見(jiàn)第一章。2.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)收集培養(yǎng)瓶中原代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的軟骨細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，取密度為lx1護(hù)Cel〕Sm/L細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。利用Amxaa細(xì)胞核轉(zhuǎn)染儀將載體轉(zhuǎn)入軟骨細(xì)胞，采用optimizedprotoeolratchonaroeytenucleoefetoTrMKit，選擇程序U24，分別加入100林L細(xì)胞懸液與5林g的pEGFP一Nl空載體以及重組載體DNA。具體操作按Amaxa
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2005
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2525803