【摘要】： 本研究利用糖尿病模型小鼠和胰島素處理體外培養(yǎng)的2細胞胚胎至囊胚期,研究早期發(fā)育環(huán)境中的胰島素對F1和F2代生長和胰島功能的代謝程序化影響;通過檢測印跡基因Igf2和H19在早期胚胎的表達和印跡控制區(qū)DNA甲基化的變化;采用基因表達譜芯片篩選相關的差異表達基因,以探討胰島素胎兒程序化作用的可能機理。 1.胰島素對小鼠早期胚胎發(fā)育的程序化影響 1.1不同劑量STZ誘導糖尿病模型小鼠 通過一次性腹腔注射150 mg/kg b.w.和200 mg/kg b.w.的鏈脲菌素(STZ)以制作小鼠糖尿病模型;采用葡萄糖測定試紙和尿液分析試紙條聯(lián)合檢測模型小鼠血糖和尿糖的變化。注射STZ后第4周測定小鼠血清葡萄糖和胰島素濃度,光鏡觀察胰島的組織學改變,并使模型小鼠與正常雄鼠交配,觀察交配和妊娠情況。結果表明:對照組血糖在觀測期基本無變化,模型組血糖水平逐漸增加,三周后穩(wěn)定。高劑量組血清葡萄糖濃度明顯升高(P＜0.001),血清胰島素水平極顯著下降(P＜0.001);胰島形態(tài)破壞嚴重;低劑量組小鼠血清葡萄糖分升高組和正常組,但血清胰島素濃度均明顯降低(P＜0.01),胰島內可見炎性細胞浸潤。血糖升高組小鼠交配能力下降,交配率僅為46.9%,流產率為73.9%,仔鼠出生死亡率為20%。結論:不同劑量的STZ均能誘發(fā)糖尿病,且影響雌鼠的交配能力和胚胎的生長發(fā)育。 1.2母體低胰島素、高血糖環(huán)境對子代生長發(fā)育和胰島功能的程序化影響 STZ誘導的糖尿病模型小鼠與正常雄鼠交配產下F1代,F1代雌鼠成年后,與正常雄鼠遠交產下F2代,觀察母體低胰島素、高血糖環(huán)境對子代(F1和F2)生長發(fā)育和胰島功能的程序化影響。結果顯示:試驗組F1代畸形率為9%,仔鼠出生重下降26.5%(P＜0.01)。F1代試驗組血清葡萄糖濃度比對照組升高24.7%(P＜0.05),血清胰島素濃度比對照組下降26%(P＜0.05)。F2代試驗組血清葡萄糖濃度與對照組沒有差異,但血清胰島素濃度比對照組下降14.3%(P＜0.05)。F1代、F2代成年鼠胰島素耐量損傷,產生胰島素抵抗,胰島凋亡細胞比例升高。提示:糖尿病母體環(huán)境影響子代胚胎發(fā)育和成年后產生胰島素抵抗,這種影響可以傳遞至F2代。 1.3植入前胚胎胰島素處理對子代生長發(fā)育和胰島功能的程序化影響 將小鼠2細胞胚胎培養(yǎng)于KSOM+0.25μg/ml Insulin的培養(yǎng)液中,發(fā)育至囊胚后轉移到假孕母鼠子宮。產下的雌鼠成年后(6周齡),與正常雄鼠遠交產下F1代,觀察暴露于高胰島素環(huán)境的早期胚胎及其子代生長發(fā)育和胰島功能的程序化影響。結果顯示:試驗組囊胚發(fā)育率升高16.4%(P＜0.05),仔鼠出生重升高17.8%(P＜0.05)。試驗組成年小鼠血清葡萄糖和胰島素濃度與對照組均無明顯差異,但胰腺凋亡細胞明顯增多,并顯示口服葡萄糖和胰島素耐量損傷;F1代試驗組血清胰島素濃度比對照組下降14.3%(P＜0.05),胰島素耐量損傷,產生胰島素抵抗。提示:胰島素能促進早期胚胎生長,但會造成成年以及F1代小鼠胰島素抵抗。 2.胰島素胎兒程序化作用的機理 2.1母體低胰島素、高血糖環(huán)境對早期胚胎印跡基因Igf2和H19表達和甲基化的影響 取糖尿病模型母鼠14天胎齡的胚胎,提取全胚胎的總RNA和DNA,檢測印跡基因Igf2和H19的表達和印跡控制區(qū)(ICR)的甲基化狀態(tài)。結果顯示:試驗組14天胚胎中Igf2 mRNA表達的相對豐度比對照組下降15.4%(P＜0.05),Real-time RT-PCR顯示Igf2mRNA表達是對照組的0.65倍(P＜0.05),而H19 mRNA表達與對照組無差異。試驗組Igf/H19印跡控制區(qū)的CpG甲基化率比對照組升高19.1%(P＞0.05)。提示:母體低胰島素、高血糖環(huán)境影響早期胎兒印跡基因Igf2/H19印跡控制區(qū)CpG甲基化率,引起Igf2 mRNA表達的改變。 2.2植入前胚胎胰島素處理對小鼠胚胎印跡基因Igf2/H19表達和甲基化的影響 將小鼠2細胞胚胎培養(yǎng)于KSOM+0.25μg/ml Insulin的培養(yǎng)基內,發(fā)育至桑椹胚和囊胚,囊胚轉移到假孕母鼠子宮。提取桑椹胚、囊胚和14天胚胎的總RNA和總DNA,檢測印跡基因Igf2和H19的表達和印跡控制區(qū)(ICR)的甲基化狀態(tài)。Real-timeRT-PCR分析表明,試驗組桑椹胚Igf2 mRNA表達是對照組的4.7倍,H19表達是對照組的5.7倍;試驗組囊胚Igf2 mRNA表達是對照組的1.8倍,H19表達量是對照組的2.3倍;14天胚胎,試驗組Igf2和H19 mRNA表達均是對照組的1.5倍(P＜0.05)。BSP測序法分析Igf2/H19印跡控制區(qū)的甲基化水平發(fā)現(xiàn),試驗組桑椹胚、囊胚和14天胚胎甲基化率分別為7.3%,32.3%和46%,分別比對照組下降86.4%,35.4%和19.2%(P＜0.01)。提示:植入前胚胎暴露于胰島素可降低Igf2/H19印跡控制區(qū)DNA甲基化的水平,從而使Igf2和H19基因表達升高。 3.基因表達譜芯片篩選與胎兒程序化作用相關的差異表達基因 取糖尿病模型小鼠和對照組小鼠14胎齡的胚胎,提取胚胎的總RNA。逆轉錄成cDNA,將Cy3和Cy5 2種熒光分別標記到試驗組和對照組的cDNA上,并與包含24859個基因的表達譜芯片進行雜交及掃描,重復3次實驗,采用Agilent掃描儀進行掃描分析,軟件讀取數(shù)據(jù),結果篩選出差異表達基因397個,其中有328個基因在試驗組表達量比對照組大2倍,69個基因在試驗組表達量比對照組小2倍,其中糖尿病相關基因Rrad(Ras-Related Associated with Diabetes)和Rasl12上調,該基因與Ⅱ型糖尿病胰島素抵抗有關;Otx2 and Robo3基因下調,其主要調節(jié)腦和神經系統(tǒng)發(fā)育及腦細胞分化。提示:母體糖尿病環(huán)境影響早期胎兒基因表達,進而影響胚胎發(fā)育。
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【學位授予單位】：南京農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R587.1;R321

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前1條

1 蔣輝;氰戊菊酯對小鼠繁殖機能及其繼代效應的研究[D];南京農業(yè)大學;2009年

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本文編號：2367941