人巨細(xì)胞病毒(HCMV)含有約20-25種蛋白質(zhì),其中在介導(dǎo)HCMV感染和病毒復(fù)制中有3種蛋白作用最為重要,即由ORF UL83編碼的pp65蛋白、ORF UL82編碼的磷蛋白pp71和ORF UL69編碼的pUL69蛋白。上述3種蛋白共同的特點(diǎn)是啟動(dòng)HCMV對(duì)宿主細(xì)胞的感染和病毒的復(fù)制,同時(shí)在逃逸T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用中也具有重要作用。新近的研究表明,在這3種間層蛋白中以O(shè)RFUL83編碼的蛋白pp65的作用最為顯著,該pp65蛋白單獨(dú)存在時(shí),是一種較強(qiáng)的抗原蛋白,可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體,有助于清除病毒;在器官移植者,HCMV的感染后pp65蛋白的產(chǎn)生可以明顯增強(qiáng)細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達(dá),從而引起移植物血管病變和排斥反應(yīng);在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤,pp6蛋白的產(chǎn)生可以引起腫瘤蛋白p105,p107,p130等的衰變。pp65蛋白可以誘導(dǎo)靜止的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期并使他們停在G1晚期,而這段時(shí)期對(duì)病毒復(fù)制最為有利,所以它能夠增加病毒繁殖,加快病毒在細(xì)胞間傳遞,體外將HCMV轉(zhuǎn)染人纖維母細(xì)胞后,病毒DNA復(fù)制效率在共轉(zhuǎn)染ORF UL83(pp65蛋白)條件下,感染及復(fù)制效率增加80倍。研究證實(shí)pp65不僅對(duì)HCMV的IE1和IE2基因表達(dá)有促進(jìn)作用,而且對(duì)晚期基因的表達(dá)以及病毒向正常宿主細(xì)胞的傳播具有促進(jìn)和加強(qiáng)作用。因此,Baldick指出,ORF UL83(pp65蛋白)可作為抗CMV病毒藥物設(shè)計(jì)的有效靶點(diǎn)。 本研究進(jìn)行了以下工作: 1.人巨細(xì)胞病毒pp65基因的克隆及pET32-pp65重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 (1) 利用蛋白酶K法提取HCMV DNA。 (2) 設(shè)計(jì)引物、PCR擴(kuò)增pp65基因目的片段。 (3) BamH Ⅰ和Xho Ⅰ內(nèi)切酶雙酶切目的片段和質(zhì)粒pET32a(+)。并將pp65基因目的片段連接到pET32a(+)上,構(gòu)建成能融合表達(dá)pp65的重組質(zhì)粒pET32-pp65。 (4) 提取重組質(zhì)粒pET32-pp65,以BamH Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切方法和PCR方法鑒定重組質(zhì)粒,說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.pET32-pp65重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達(dá)及分離純化 利用IPTG誘導(dǎo)重組基因獲得了高效表達(dá),當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃、誘導(dǎo)時(shí)間4h、



本文編號(hào)：2282650