本文選題：免疫耐受　切入點：免疫激活　出處：《復旦大學》2006年博士論文

【摘要】： 機體對自身抗原免疫無應(yīng)答是免疫耐受的主要體現(xiàn)，它對于建立和維持機體免疫自穩(wěn)、預防自身免疫性疾病的發(fā)生具有重要的意義。然而，慢性感染性病原體以及改變的自身抗原——腫瘤抗原則通過尚未完全明確的機制誘導了機體免疫系統(tǒng)對這些抗原的特異性免疫耐受，從而導致病原體的慢性感染和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 絕大多數(shù)腫瘤抗原是機體自身蛋白質(zhì)，僅在腫瘤發(fā)生時過量或異位表達，由于機體免疫系統(tǒng)對自身抗原的免疫耐受，因此難以激發(fā)對腫瘤抗原有效的免疫應(yīng)答，不能清除腫瘤；同樣，在慢性乙型肝炎中機體對乙肝病毒(HBV)表面抗原(HBsAg)的先天或獲得性免疫耐受亦是乙肝慢性感染的重要原因之一，使得至今尚無有效方法防治腫瘤和慢性乙肝的發(fā)生。此外，免疫耐受的失衡與一些疾病的發(fā)生密切相關(guān)，如TNBS誘導的炎癥性結(jié)腸炎是一種由過度炎性反應(yīng)導致腸道炎癥損傷的難治性疾病，作為自身抗原的IL-12過量表達是引起炎癥性結(jié)腸炎的主要原因之一。 因此，如何清除過度表達的腫瘤抗原、自身抗原或病毒性抗原以維持機體免疫自穩(wěn)呢?從根本而言，唯有打破對腫瘤抗原和病原體抗原以及自身抗原的免疫耐受，誘導針對腫瘤抗原、病毒性抗原或自身抗原的特異性免疫應(yīng)答以清除過度表達的抗原，是用主動手段消除腫瘤或自身抗原過表達或病毒抗原表達導致的炎癥病理反應(yīng)、有效防治腫瘤、慢性感染性疾病等的根本策略。 如何打破自身免疫耐受、誘導針對已發(fā)生天然或獲得性免疫耐受的自身或外源抗原的特異性免疫應(yīng)答呢?已知APC對抗原的有效處理和提呈是誘導特異性免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，專職APC—DC的成熟狀態(tài)、表面MHC分子、共刺激分子的表達水平極大程度決定了免疫激活或者免疫耐受的發(fā)生。有研究顯示：若以未成熟DC荷抗原肽免疫小鼠時，，在引流淋巴結(jié)中T-DC細胞僅有多次短暫接觸，結(jié)果引起免疫耐受，而以成熟DC荷相同抗原肽免疫小鼠時，T-DC長時間穩(wěn)定接觸，最終引起免疫激活。通常認為DC遷移的過程伴隨著其成熟，未成熟DC介導免疫耐受，而成熟DC誘生免疫應(yīng)答。以上研究提示：通過調(diào)控機體專職APC的抗原提呈功能和提呈效率，可能克服機體對抗原的免疫耐受狀態(tài)，再次誘導免疫應(yīng)答來清除耐受原，從而降低相關(guān)疾病的發(fā)病或致病程度。為此，本研究提出設(shè)想：如果通過人為方法，將大量DC富集在抗原免疫部位，并通過一定手段促使DC成熟，則可能通過增強DC對自身抗原的提呈，誘導對耐受原的有效應(yīng)答、清除過量表達的耐受原，達到防治慢性感染性疾病、腫瘤及自身免疫病的功能。 若要實現(xiàn)上述假設(shè)，首先必須將大量DC趨化到抗原局部，而趨化因子就具有趨化免疫細胞到達感染或免疫部位、活化免疫細胞的功能。因此我們希望通過趨化因子來趨化DC到達免疫局部和增強抗原提呈功能。CCL20是CC家族中的趨化因子，主要趨化未成熟DC、活化的B細胞和T細胞。以往研究表明CCL20基因免疫可招募大量未成熟DC發(fā)揮抗腫瘤作用。此外，F(xiàn)lt3L是一種具有促進骨髓造血干細胞生長和前體細胞分化、成熟的細胞因子，有助于DC增殖和成熟。 在以上研究基礎(chǔ)和背景下，本研究提出如下設(shè)想：聯(lián)合應(yīng)用自身抗原或病毒抗原基因疫苗和CCL20、flt3L佐劑基因進行基因共免疫，通過增強基因疫苗的免疫效果，希望能打破機體對自身抗原的免疫耐受。其中，CCL20有助于招募大量未成熟DC到達免疫局部，而flt3L則促進DC在遷移至引流淋巴結(jié)的過程中發(fā)育成熟并上調(diào)抗原提呈功能，從而更有效激活T細胞，誘導特異性免疫應(yīng)答。以自身抗原-CCL20-flt3L聯(lián)合基因免疫策略有望打破對自身／人工耐受抗原的耐受狀態(tài)，誘導對耐受抗原的特異性免疫應(yīng)答。為證實這種假設(shè)，本研究選取三種不同抗原(B16F10腫瘤模型的mgp100自身抗原、HBV轉(zhuǎn)基因鼠的HBsAg人工耐受原、TNBS誘導的炎癥性結(jié)腸炎中的IL-12p40自身抗原)進行平行研究以探討自身抗原(病毒抗原)／CCL20／flt3L基因共免疫策略是否有助于打破對自身抗原／病毒抗原的免疫耐受狀態(tài)。在此基礎(chǔ)上，進一步觀察該策略誘導的增強的特異性免疫應(yīng)答是否可對疾病動物模型產(chǎn)生免疫保護作用；并對其預防或治療作用的機制進行探討，以期為相關(guān)疾病的生物學防治提供新的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。 1．多種重組質(zhì)粒的構(gòu)建、體外表達及功能分析 我們首先構(gòu)建了含有趨化因子CCL20、細胞因子flt3L、自身抗原TL-12p40亞基和其融合基因的質(zhì)粒pcDNA3-CCL20(pCCL20)、pcDNA3-flt3L(pf3L)、pcDNA3-IL-12p40(p40)、pcDNA3-CCL20-flt3L(pCCL20-f3L)、pcDNA3-CCL20-IL-12p40-flt3L(pCCL20-40-f3L)等。以電穿孔法將質(zhì)粒導入C2C12小鼠肌細胞，獲得轉(zhuǎn)染細胞C2C12-CCL20、C2C12-flt3L、C2C12-IL-12p40等。將以上轉(zhuǎn)染細胞的表達上清濃縮后進行Western blot分析可見明顯特異性條帶，證實以上所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠在體外進行有效表達。pCCL20表達上清的活性分析顯示：該表達上清對脾淋巴細胞有明顯的趨化作用，趨化指數(shù)達9.18±0.78，而不含有該趨化因子的表達上清則對脾淋巴細胞不表現(xiàn)出明顯的趨化效應(yīng)，其趨化指數(shù)為0.84±0.40(P=0.001)。體內(nèi)實驗顯示：CCL20能夠趨化細胞到達局部免疫部位，其細胞浸潤指數(shù)為1.667±0.333，比對照組(0.333±0.211)顯著增加(P=0.007)。進一步的研究顯示CCL20趨化細胞到達免疫局部的效應(yīng)不僅增強體液免疫，而且可增強細胞免疫。flt3L的活性分析顯示：該細胞因子對培養(yǎng)的樹突狀細胞表面共刺激分子有明顯的上調(diào)作用，即可促進DC的成熟，培養(yǎng)上清細胞因子檢測顯示IL-12p70的表達顯著增加，為660.9±25.44pg／ml，而對照組為110.4±11.03pg／ml(P=0.000)，也從另外一個側(cè)面證實了該細胞因子有促進DC成熟的作用。 以上結(jié)果提示：所有構(gòu)建的重組質(zhì)粒均可在體外得到有效表達，且表達的CCL20和flt3L蛋白具有相應(yīng)的生物學功能。 2．CCL20／flt3L／p40基因共免疫可打破機體對p40的免疫耐受 為了研究采用pCCL20／pflt3L／pIL-12p40質(zhì)粒共免疫是否能夠打破針對自身抗原p40的免疫耐受，我們通過肌肉注射基因免疫的方式，將含有CCL20、flt3L和p40的重組質(zhì)粒以及pcDNA3-CCL20-flt3L(pCCL20-f3L)、pcDNA3-CCL20-IL-12p40-flt3L(pCCL20-40-f3L)的含有融合基因的質(zhì)粒免疫6-8周齡的雌性BALB／c小鼠。單一重組質(zhì)�；旌厦庖呓M和融合質(zhì)粒免疫組均在加強免疫后一周出現(xiàn)抗IL-12p40抗體，提示免疫后IL-12p40的免疫耐受被打破，但該抗體的滴度較低，二次加強免疫也不能有效提高抗體的水平。為了有效提高抗體的產(chǎn)生，我們進一步優(yōu)化了免疫策略，發(fā)現(xiàn)在含有CCL20、flt3L和p40的重組質(zhì)粒的質(zhì)量比為4：4：100時，抗IL-p40抗體的效價最好，經(jīng)再次免疫后一周，抗體滴度達最高，為1：8000；局部免疫部位的DC細胞浸潤數(shù)目達最多，然而，若進一步提高趨化因子CCL20和flt3L重組質(zhì)粒的濃度，其細胞的浸潤程度并不增加(P＞0.05)，而抗體的效價反而下降(P＜0.05)。改變幾種重組融合質(zhì)粒的量和比例進行免疫始終未能提高抗體的效價，因此本研究的后續(xù)實驗均采用三種質(zhì)粒的量的比例(抗原：CCL20：flt3L)為4：4：100的單一質(zhì)粒混合免疫方式進行免疫。 以上結(jié)果表明只有pCCL20、pflt3L和含編碼自身抗原p40的重組質(zhì)粒共免疫才能夠打破針對IL-12p40的免疫耐受。為進一步確認IL-12p40的耐受狀態(tài)是否被打破，我們系統(tǒng)研究了抗體產(chǎn)生的滴度、特異性和親和力。我們采用0、3、6w免疫方案，在免疫的第2、4、6、8、10、12w分別收集小鼠血清進行抗體的檢測。結(jié)果顯示：單純使用不同劑量的pIL-12p40免疫，均不能產(chǎn)生針對p40的特異性抗體；在pIL-12p40／pCCL20共免疫組和pIL-12p40／pflt3L共免疫組也未能檢測到相應(yīng)抗體的存在；但在pIL-12p40／pCCL20／pflt3L質(zhì)粒共免疫組卻能夠檢測到抗體的存在，在第8周其抗體滴度達1：3600。以硫氰酸鹽競爭抑制法測定其抗體的親和力表明在第4、8周分別為1.3、1.5。以重組IL-12p40蛋白進行血清中和實驗發(fā)現(xiàn)，該抗體可以被重組IL-12p40中和，中和后抗體檢測OD值為0.149±0.03，顯著低于未加入IL-12p40中和的對照組(0.97±0.14)(P=0.005)，表明其為抗-p40特異性抗體。 以上結(jié)果顯示使用pCCL20、pflt3L和含編碼自身抗原p40重組質(zhì)粒共免疫策略能夠產(chǎn)生針對p40的特異性的體液免疫。為進一步確證該免疫方案能否打破針對p40的免疫耐受，我們檢測了免疫小鼠的細胞免疫應(yīng)答水平。結(jié)果顯示：由特異性抗原p40(5μg／ml)引起的增殖反應(yīng)可以被系列稀釋的免疫小鼠的抗血清所抑制(若這一反應(yīng)是由IL-2而非p40引起，則該反應(yīng)不會被系列稀釋的免疫小鼠的抗血清所抑制)，表明該增殖反應(yīng)是p40特異性的。脾臟CD8~+IFN-γ~+T效應(yīng)細胞的存在是被免疫動物存在細胞免疫反應(yīng)的主要指標之一。經(jīng)FACS分析脾臟CD8~+IFN-γ~+T細胞顯示：在pcDNA3、pIL-12p40、pIL-12p40／pCCL20、pIL-12p40／pflt3L、pIL-12p40／pCCL20／pflt3L質(zhì)粒共免疫組CD8~+IFN-γ~+T效應(yīng)細胞的比例分別為0.25±0.04％、0.23±0.01％、0.27±0.05％、0.27±0.06％、1.64±0.09％。pIL-12p40、pCCL20和pflt3L三質(zhì)粒共免疫組CD8~+IFN-γ~+T效應(yīng)細胞比例顯著高于其他組(P=0.000)，而其他各組之間則沒有顯著的差別(P值均大于0.05)。 以上結(jié)果提示，無論是在體液免疫水平還是在細胞免疫水平，只有用pCCL20、pflt3L和含編碼自身抗原p40的重組質(zhì)粒共免疫才能打破針對p40的免疫耐受。 3．CCL20／flt3L／p40基因共免疫可防治炎癥性結(jié)腸炎 由TNBS誘導產(chǎn)生的炎癥性結(jié)腸炎動物模型是Th1型的，主要由效應(yīng)分子IL-12介導。而IL-12是由p35和p40兩個亞基組成的異二聚體分子，其生物學效應(yīng)的發(fā)揮有賴于其完整的結(jié)構(gòu)。已有的文獻顯示p40基因敲除小鼠，TNBS誘導的炎癥性結(jié)腸炎明顯減輕。為了驗證產(chǎn)生的抗-p40特異性抗體的效應(yīng)，我們首先復制了TNBS介導的炎癥性結(jié)腸炎模型。結(jié)果顯示：在對照組小鼠，即40％乙醇處理組，在用藥后小鼠的體重呈增加趨勢，其波動范圍在100-110％范圍內(nèi)(103.30±0.75)；而TNBS處理組(0天、7天兩次給藥)則在第2天和第9天由于腹瀉脫水體重降至最低，分別為其0天體重的84.5％和87.2％，在9天時間內(nèi)體重均未回升到第0天的基礎(chǔ)水平(91.37±1.77)。在TNBS處理組，小鼠的患病率為100％，大體肉眼觀察積分為11.63±0.53，髓過氧化物酶水平為1.26±0.05 OD／g組織，結(jié)腸的濕／干比為6.45±0.16，平均食物消耗量為1-2(1.53±0.14)g／天，而40％乙醇處理組，小鼠的患病率為6.25％，大體肉眼觀察積分為0.88±0.40，髓過氧化物酶水平為0.61±0.02 OD／g組織，結(jié)腸的濕／干比為4.18±0.12，食物平均消耗量為4-6(5.30±0.12)g／天。以上有關(guān)炎癥性結(jié)腸炎的各項指標，40％乙醇處理組和TNBS處理組之間均表現(xiàn)顯著差異(P均小于0.001)。形態(tài)學觀察顯示TNBS處理組小鼠結(jié)腸沒有或者少有糞便充盈，明顯區(qū)別于40％乙醇處理組小鼠的大量節(jié)段性的糞便充盈，且其脾臟相對于40％乙醇處理組小鼠明顯增大。組織學研究顯示40％乙醇處理組小鼠的結(jié)腸腸腔規(guī)則，絨毛伸入腸腔，僅有少量炎癥細胞浸潤；而TNBS處理組小鼠的黏膜層呈節(jié)段性破壞，有大量的炎癥細胞浸潤，局部黏膜層甚至完全消失。在TNBS處理后5w的小鼠結(jié)腸表面有大量不規(guī)則分布的結(jié)節(jié)，幾乎無糞便充盈，組織學顯示大量細胞浸潤于黏膜層及黏膜層和肌層之間，呈現(xiàn)慢性炎癥表象。 在復制結(jié)腸炎動物模型的基礎(chǔ)上，我們在建模后一周，進行pIL-12p40／pCCL20／pflt3L質(zhì)粒共免疫，3周后加強免疫一次，再一周后處死小鼠，進行組織學觀察顯示：在經(jīng)TNBS處理后免疫組小鼠結(jié)腸未見明顯的炎癥細胞浸潤，結(jié)腸的大體結(jié)構(gòu)未明顯受損，絕大多數(shù)結(jié)腸有規(guī)則的糞便充盈，腎臟免疫組化未見有明顯的免疫復合物沉積；對于經(jīng)TNBS處理后未免疫組，則絕大多數(shù)結(jié)腸無糞便充盈，表面有不規(guī)則突起和水腫表現(xiàn)，組織學顯示有大量單個核細胞浸潤，局部組織破壞嚴重。 抗IL-12p40抗體產(chǎn)生后對TNBS誘導的結(jié)腸炎的預防作用的實驗研究顯示：小鼠再次免疫一周后，以TNBS誘導結(jié)腸炎模型，僅有29.2±11.0％的小鼠患病，且其患病的程度也大為減輕。具體表現(xiàn)為：其體重的降低不低于0天的90％，且在TNBS處理第二天開始即上升，到第6-7天就恢復到初始水平。其食物消耗量為每天3.54±0.51g，髓過氧化物酶MPO水平為0.81±0.04 OD／g組織，結(jié)腸的濕／干比為5.21±0.20，大體肉眼觀察積分為2.00±0.87，與TNBS處理組比較均有顯著性差異(P均小于0.001)。形態(tài)學研究表明免疫后小鼠進行TNBS處理，結(jié)腸的大體形態(tài)無明顯異常，脾臟有增大，組織學觀察顯示有部分小鼠的黏膜層內(nèi)有少量的炎癥細胞浸潤，但黏膜層、肌層的大體形態(tài)仍然完好。這些結(jié)果提示進行pIL-12p40／pCCL20／pflt3L質(zhì)粒共免疫打破IL-12p40的免疫耐受后對由TNBS介導的Th1型炎癥性結(jié)腸炎模型具有有效的防治作用。 4．CCL20／flt3L／p40基因共免疫打破p40免疫耐受機制的研究 正常情況下，機體不會對自身的成分產(chǎn)生免疫應(yīng)答，而我們以含有CCL20、flt3L的重組質(zhì)粒和含編碼自身抗原p40的重組質(zhì)粒共免疫的方式卻打破了針對p40的免疫耐受。為了進一步探討該實驗現(xiàn)象的機制，我們以相同的免疫劑量和免疫方式對BALB／c小鼠進行肌肉免疫，結(jié)果顯示在單獨使用pIL-12p40免疫時，肌肉局部僅有很少的炎性細胞浸潤(0.67±0.21)，而pIL-12p40／pCCL20共免疫組有較多的炎性細胞浸潤(1.67±0.33)，pIL-12p40／pCCL20／pflt3L三質(zhì)粒共免疫組有大量的細胞浸潤(2.67±0.21)(三組比較P值均小于0.01)�；贑CL20僅對CCR6~+的細胞有趨化作用，CCR6~+表達于T、B、DC細胞上，而flt3L能夠促進骨髓細胞的擴增和成熟，因此我們分別以免疫組化和流式細胞術(shù)對局部浸潤細胞的種類進行了分析。免疫組化結(jié)果顯示：該群細胞絕大部分為S100~+CD19~-CD3~-的細胞，而FACS結(jié)果表明該群細胞的81.26％為CD11c~+CD19~-CD3~-的細胞，兩種實驗方法均提示在局部浸潤的是樹突狀細胞。以抗-CCR6的抗體局部注射pCCL20、pflt3L和pIL-12p40共免疫的小鼠，局部免疫部位的細胞浸潤顯著減少(3.00±0.00 vs 1.50±0.34，P=0.000)，且在抗-CCR6抗體封閉組小鼠血清中未檢測到抗-p40抗體的產(chǎn)生。 通常，免疫學理論認為未成熟DC介導免疫耐受，而成熟DC與免疫應(yīng)答的激活有關(guān)。因此，以CCL20、flt3L的重組質(zhì)粒和含編碼自身抗原p40的重組質(zhì)粒共免疫的方式打破針對p40的免疫耐受現(xiàn)象是否是由于改變了DC的成熟度呢?為深入探討該推論，我們進一步觀察了免疫7天后脾臟和局部引流淋巴結(jié)的DC數(shù)量和成熟度。結(jié)果顯示：在局部引流淋巴結(jié)，pIL-12p4／pCCL20／pflt3L三質(zhì)粒共免疫組DC的數(shù)量(21.10±2.10×10~3／LN)較pcDNA3免疫組(7.41±0.42×10~3／LN)、pIL-12p40免疫組(7.85±0.19×10~3／LN)、pIL-12p40／pCCL20免疫組(9.05±0.23×10~3／LN)、pIL-12p40／pflt3L免疫組(7.83±0.20×10~3／LN)均顯著增加(P均小于0.001)，而其他組之間未見顯著差異(P均大于0.05)。同時在局部引流淋巴結(jié)，pIL-12p40／pCCL20／pflt3L三質(zhì)粒共免疫組DC分子表面共刺激分子CD80／CD86／CD40和MHCⅡ類分子的平均熒光強度(成熟度)較pcDNA3免疫組、pIL-12p40免疫組、pIL-12p40／pCCL20免疫組、pIL-12p40／pflt3L免疫組均顯著增加(P均小于0.05)，而其他組之間未見顯著差異(P均大于0.05)。在脾臟，pIL-12p40／pCCL20／pflt3L三質(zhì)粒共免疫組DC的數(shù)量和成熟度較pcDNA3免疫組、pIL-12p40免疫組、pIL-12p／40／pCCL20免疫組、pIL-12p40／pflt3L免疫組均未見顯著增加(P均大于0.05)。提示CCR6~+的DC細胞在肌肉注射局部的大量浸潤，以及在局部引流淋巴結(jié)的成熟度增加可能是導致自身抗原p40免疫耐受被打破的原因。 綜上所述，單純以編碼自身抗原基因IL-12p40的重組質(zhì)粒免疫小鼠不能產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，采用含CCL20、flt3L和自身抗原的編碼基因的重組質(zhì)粒共免疫可打破對自身抗原TL-12p40的免疫耐受，產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，該免疫應(yīng)答對由TNBS誘導產(chǎn)生的由IL-12這一效應(yīng)分子介導的Th1型炎癥性結(jié)腸炎模型具有有效的防治作用。對該現(xiàn)象機制的進一步研究顯示：在含CCL20、flt3L和自身抗原p40的編碼基因的重組質(zhì)粒共免疫局部免疫部位浸潤的細胞絕大部分為DC，用抗-CCR6抗體可以封閉DC浸潤至局部免疫部位和特異性抗體的產(chǎn)生，在免疫附近的引流淋巴結(jié)DC細胞的數(shù)量和成熟度顯著增加。本課題中除使用IL-12p40這一自身抗原外，我們還采用含CCL20／flt3L／HBsAg的重組質(zhì)粒共免疫HBV轉(zhuǎn)基因鼠打破了HBsAg的免疫耐受(見附件2)；用含CCL20／flt3L／mgp100的重組質(zhì)粒共免疫誘導C57BL／6小鼠針對mgp100的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)，后者對B16F10腫瘤細胞的攻擊具有免疫保護作用(見附件1)。本研究提示提高免疫局部DC細胞的數(shù)量和成熟度可逆轉(zhuǎn)機體對自身抗原的免疫耐受狀態(tài)，通過打破對自身抗原的耐受可誘導針對自身抗原或病毒抗原的特異性免疫應(yīng)答，從而有效防治自身免疫病的發(fā)生發(fā)展。本研究為臨床治療自身抗原過量表達引起的自身免疫疾病提供了理論和實驗基礎(chǔ)，同時為通過打破免疫耐受對腫瘤以及病毒慢性感染進行主動免疫防治提供了新的策略和思路。
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【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2006
【分類號】：R392

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：1663137