本文關(guān)鍵詞： 骨髓間充質(zhì)干細胞 增殖 分化 褪黑素 褪黑素受體　出處：《山西醫(yī)科大學(xué)》2007年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】： 目的:探討褪黑素(melatonin,Mel)對人骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stemcells,MSCs)增殖分化的作用,以期優(yōu)化MSCs擴增及向神經(jīng)元樣細分化的實驗參數(shù);研究Mel干預(yù)的MSCs上Mel受體亞型mRNA的表達情況,為進一步研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 方法:1.以密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)方法分離MSCs,以含15%胎牛血清L-DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng),用流式細胞儀檢測CD45、CD44、CD105。2.取傳至6代的MSCs,加入不同濃度的Mel,MTT法分別檢測24小時、3天、5天細胞的增殖情況;免疫細胞化學(xué)法和RT—PCR法檢測Mel誘導(dǎo)后24h、3天、5天MSCs表面NSE、GFAP的表達。3.RT—PCR法測定Mel誘導(dǎo)的第6代MSCs上,Mel受體MT_1和MT_2mRNA的表達情況:提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄,PCR擴增,凝膠電泳,體外基因測序。 結(jié)果:1.MSCs接種后貼壁良好,折光性強,3天后可見梭狀或多邊形細胞呈集落狀生長,傳代迅速,至第5～6代時呈現(xiàn)較均一的成纖維細胞樣形態(tài)。流式細胞法檢測結(jié)果為:CD44~-、CD105~+、CD45~-,證明為較純的MSCs。2.加入Mel后,實驗組MSCs增殖情況和對照組比較,差異不顯著。加入Mel后24小時鏡下觀察見MSCs形態(tài)發(fā)生變化,寬大扁平的細胞體向胞核收縮,出現(xiàn)雙極及多極細胞,有細長突起,3天后變形細胞增多,細長突起相互連接、交織。持續(xù)至5天后變形細胞達到高峰。免疫細胞化學(xué)法測得誘導(dǎo)后24h、3d、5d Mel高濃度組和低濃度組的NSE染色陽性率較對照組差異顯著;各組GFAP染色均呈陰性。3.RT—PeR:提MSCs總RNA,行RT-PeR,瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)一陽性條帶,分子量約為370bp,與MT_1引物核苷酸數(shù)目(368bp)相符合,320bp附近未出現(xiàn)陽性條帶。測序結(jié)果示,擴增獲得的基因序列與Genbank中人MT_1受體亞型的基因序列相吻合。 結(jié)論:1.本實驗采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁純化MSCs,建立了穩(wěn)定的MSCs培養(yǎng)增值體系,細胞成活率高,貼壁良好,可連續(xù)傳15代。該采集方法簡便易行,體外擴增容易,細胞獲得豐富,可推薦為MSCs研究的常規(guī)培養(yǎng)方法。2.在Mel誘導(dǎo)下,MSCs可分化為神經(jīng)元樣細胞;Mel對MSCs的增殖無明顯作用。3.本實驗用RT-PCR技術(shù),初步證實被Mel誘導(dǎo)的MSCs存在MT_1受體mRNA的表達;通過測序,擴增所獲得的基因序列與GenBank的人MT_1受體亞型的基因序列相一致,提示Mel干預(yù)的MSCs存在MT_1受體mRNA的表達。本實驗未檢測到亞型MW_2 mRNA的表達,可能因為Mel干預(yù)的MSCs不存在MT_2mRNA的表達。
[Abstract]:Objective: to investigate the effect of melatonin on the proliferation and differentiation of mesenchymal stem cells (MSCs) of human bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) in order to optimize the experimental parameters of MSCs amplification and neuron-like fine differentiation, and to study the expression of Mel receptor subtype mRNA on MSCs induced by Mel. To lay a foundation for further research and clinical application. Methods 1. MSCs were separated by density gradient centrifugation combined with adherent culture, and cultured on L-DMEM medium containing 15% fetal bovine serum. Flow cytometry (FCM) was used to detect CD45, CD44and CD105.2. The proliferation of cells was detected by different concentrations of Melton-MTT assay after 6 passages of MSCs were added to detect the proliferation of cells in 24 hours and 3 days and 5 days respectively. Immunocytochemistry and RT-PCR methods were used to detect the expression of MSCs on MSCs surface at 3 and 5 days after Mel induction. 3. RT-PCR was used to detect the expression of Mel receptor MT_1 and MT_2mRNA on the sixth generation MSCs induced by Mel: total RNAs, RT-PCR amplification, gel electrophoresis and gene sequencing in vitro. Results\\\%\\%\\\%\%\%\%\%\%. The results of flow cytometry were as follows: 1. The results of flow cytometry were as follows: 1. The results of flow cytometry showed that it was a pure MSCs.2.After the addition of Mel, the proliferation of MSCs in the experimental group was compared with that in the control group. The morphologic changes of MSCs were observed under microscope 24 hours after the addition of Mel. The large, flat cell bodies contracted to the nucleus, bipolar and multipolar cells appeared. After 3 days, the number of deformable cells increased and the slender processes were connected with each other. The positive rates of NSE staining in high concentration and low concentration Mel groups were significantly higher than those in control group 24 h after induction at 3 d and 5 d after induction by immunocytochemistry. GFAP staining was negative in all groups. RT-PeR: total MSCs RNA was extracted. A positive band was detected by RT-PeR and agarose gel electrophoresis with a molecular weight of about 370 BP, which coincided with the number of MT_1 primer nucleotides and there were no positive bands in the vicinity of 320bp. The amplified gene sequence coincided with the gene sequence of human MT_1 receptor subtype in Genbank. Conclusion 1. In this experiment, a stable culture system of MSCs was established by density gradient centrifugation combined with adherent purification. The cell survival rate was high, the adherent was good, and the cells could be transmitted for 15 consecutive generations. The method was simple and easy to amplify in vitro. The cells were abundant and could be recommended as a conventional culture method for the study of MSCs. (2) MSCs could differentiate into neuron-like cells. Mel had no obvious effect on the proliferation of MSCs. 3. RT-PCR technique was used in this experiment. The expression of MT_1 receptor mRNA in MSCs induced by Mel was preliminarily confirmed, and the sequence obtained by sequencing was consistent with that of human MT_1 receptor subtype of GenBank. The results suggested that MT_1 receptor mRNA was expressed in MSCs treated with Mel, but no expression of MW_2 mRNA was detected in this study, which may be due to the absence of MT_2mRNA expression in Mel induced MSCs.
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號】：R329

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 鐘偉;楊希營;王韶峰;尹崇高;賀良;;TGF-β1增強大鼠BMMSCs的侵襲能力研究[J];中華全科醫(yī)學(xué);2011年09期

2 王艷春;閆承慧;劉晶;韓雅玲;;獨參湯促進骨髓間充質(zhì)干細胞體外增殖:最佳干預(yù)劑量的篩選[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年23期

3 張文信;劉金文;曹學(xué)偉;葉青合;;金匱腎氣丸含藥血清對體外兔BMSCs增殖細胞周期及凋亡的影響[J];遼寧中醫(yī)雜志;2011年08期

4 劉偉;趙勁民;蘇偉;李曉峰;秦義武;;骨碎補總黃酮可促進兔骨髓間充質(zhì)干細胞的增殖和分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年32期

5 謝興文;宋敏;金成強;;接骨散含藥血清對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與成骨性分化影響[J];中國中醫(yī)骨傷科雜志;2011年06期

6 謝興文;許偉;李寧;;羌活魚含藥血清對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化的影響[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年32期

7 盤榮貴;范揺;鄧耀良;趙勁民;;同種異基因成骨細胞對混合淋巴細胞反應(yīng)體系中T細胞的免疫抑制[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年27期

8 ;本期專題:骨髓間充質(zhì)干細胞與肝細胞修復(fù)及組織重構(gòu)(本刊中文部)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年23期

9 韓桂秋;葛寶豐;陳克明;馬慧萍;;金雀異黃酮對體外培養(yǎng)缺氧大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖與成骨分化的影響[J];中國藥學(xué)雜志;2011年16期

10 ;骨髓間充質(zhì)干細胞與肝細胞修復(fù)及組織重構(gòu)[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年23期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳玉;張勇剛;吳秦潔;胡火珍;;小鼠神經(jīng)干細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞的共培養(yǎng)[A];中國細胞生物學(xué)學(xué)會第九次會員代表大會暨青年學(xué)術(shù)大會論文摘要集[C];2007年

2 楊世杰;王艷春;李紅;李晶;;牛磺酸抑制心肌細胞凋亡及心肌成纖維細胞增殖的實驗研究[A];中國藥理學(xué)會第九次全國會員代表大會暨全國藥理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

3 高玉環(huán);黃晨;劉麗宏;;B淋巴細胞刺激因子對多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226生長調(diào)控的研究[A];第三屆中國腫瘤內(nèi)科大會教育集暨論文集[C];2009年

4 高玉環(huán);黃晨;劉麗宏;劉海生;;B淋巴細胞刺激因子對多發(fā)性骨髓瘤細胞株RPMI8226生長調(diào)控的研究[A];第五屆全國中醫(yī)藥免疫學(xué)術(shù)研討會——暨環(huán)境·免疫與腫瘤防治綜合交叉會議論文匯編[C];2009年

5 遇秀玲;田克恭;藺會云;吳娜;;BV、HSV-1、HSV-2在Vero細胞上增殖的比較研究[A];中國實驗動物學(xué)會第五屆學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2000年

6 李兆忠;張玲;王蕓;毛海婷;李曉冰;;c-myc反義基因?qū)θ烁咿D(zhuǎn)移肺癌細胞增殖和粘附活性的抑制作用[A];山東免疫學(xué)會、山東微生物學(xué)會醫(yī)學(xué)微生物學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)學(xué)會微生物學(xué)和免疫學(xué)專業(yè)委員會、山東省醫(yī)藥生物技術(shù)學(xué)會2001年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2001年

7 肖軍花;丁麗麗;王嘉陵;;異蓮心堿抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)豬冠脈平滑肌細胞增殖及機制[A];第八屆全國生化藥理學(xué)術(shù)討論會暨第七屆Servier獎頒獎大會會議摘要集[C];2003年

8 康樂;姚東璧;胡庭俊;曾蕓;韋英益;李躍華;;天門冬多糖對小鼠脾臟淋巴細胞體外增殖的影響[A];紀念中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會中獸醫(yī)學(xué)分會成立30周年中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會中獸醫(yī)學(xué)分會2009年學(xué)術(shù)年會、華東區(qū)第十九次中獸醫(yī)科研協(xié)作與學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2009年

9 高福祿;牛嗣云;龐小靜;陳龍;李秀華;;胎兒睪丸發(fā)生過程中生殖細胞的增殖與凋亡[A];解剖學(xué)雜志——中國解剖學(xué)會2002年年會文摘匯編[C];2002年

10 王明國;王中和;蔡以理;;MAb225調(diào)控口腔鱗癌細胞增殖和放射敏感性的實驗研究[A];2004年口腔頜面腫瘤基礎(chǔ)研究學(xué)術(shù)研討會會議日程及論文集[C];2004年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 靳共元;關(guān)于“增值”與“增殖”[N];山西經(jīng)濟日報;2002年

2 趙煒;骨髓間充質(zhì)干細胞可減輕排異反應(yīng)[N];健康報;2004年

3 韓朝華;“增值”與“增殖”[N];中國社會科學(xué)院院報;2003年

4 中國社科院經(jīng)濟研究所 韓朝華;增值≠增殖[N];中國信息報;2003年

5 張中橋;血竭能促進角質(zhì)形成細胞增殖[N];中國醫(yī)藥報;2005年

6 孫友;資源儲量：在深化認識中“增殖”[N];中國石化報;2004年

7 通訊員 涂定卓 周衛(wèi)平 盧山;洪湖濕地投放100萬尾魚苗[N];湖北科技報;2006年

8 本報記者 李明;海洋漁業(yè)資源增殖為何“叫好不叫座”[N];中國海洋報;2004年

9 湖南省腫瘤醫(yī)院 唐石初副主任醫(yī)師;癌細胞的惡性特征[N];大眾衛(wèi)生報;2000年

10 吳曉慧;用廢舊輪胎增殖海參[N];中國海洋報;2000年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 于麗;腺病毒介導(dǎo)TWEAK基因?qū)Υ笫蠊撬栝g充質(zhì)干細胞作用研究[D];吉林大學(xué);2009年

2 李海生;低氧促進人骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和分化及其機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2005年

3 史達;木豆葉聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞治療股骨頭壞死的實驗與相關(guān)臨床研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2007年

4 顧紹峰;兔骨髓間充質(zhì)干細胞分化為角膜上皮樣細胞的體外研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2008年

5 張偉;骨髓間充質(zhì)干細胞免疫調(diào)節(jié)機制的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2004年

6 張海峰;骨髓間充質(zhì)干細胞移植對大鼠急性肝功能衰竭治療作用的實驗研究[D];山東大學(xué);2007年

7 牟大鵬;抑制消減雜交技術(shù)篩選骨髓間充質(zhì)干細胞誘導(dǎo)分化前后差異表達基因[D];吉林大學(xué);2007年

8 景紅;大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)為腎臟系膜細胞樣細胞的實驗研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

9 宋可新;黑色素細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞復(fù)合構(gòu)建組織工程皮膚的初步研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

10 滕春燕;骨髓間充質(zhì)干細胞對急性胰腺炎損傷修復(fù)及其機制的實驗研究[D];吉林大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李麗;褪黑素對人骨髓間充質(zhì)干細胞的作用研究及其機制初步探討[D];山西醫(yī)科大學(xué);2007年

2 嚴潤彬;胞外基質(zhì)對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響[D];重慶大學(xué);2005年

3 宋遠會;肌腱細胞微環(huán)境對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和腱/韌帶相關(guān)基因表達影響的實驗研究[D];重慶大學(xué);2009年

4 王洋;堿性成纖維細胞生長因子及維生素C對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響[D];中國醫(yī)科大學(xué);2005年

5 劉韶英;淫羊藿苷對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖及向心肌細胞分化的影響[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2008年

6 周婭蕾;低強度脈沖電磁場對體外培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的影響[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

7 王挺;兔異體血清及組織提取物對骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和分化作用的研究[D];浙江大學(xué);2006年

8 鄭曉黎;蛇床子素對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖和骨向分化的影響[D];暨南大學(xué);2008年

9 張兆清;復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細胞的組織工程皮膚修復(fù)皮膚缺損[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2006年

10 章永江;兔骨髓間充質(zhì)干細胞生物學(xué)特性和自體皮下移植的成骨研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2005年

，

本文編號：1497788