本文關鍵詞： 內毒素 定向進化 噬菌體隨機肽庫 多肽 腫瘤壞死因子　出處：《第三軍醫(yī)大學》2007年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】： 研究背景和目的: 膿毒血癥是臨床ICU病人死亡的重要原因。據統(tǒng)計,在美國每年有650 750,000住院病人發(fā)展為膿毒血癥,在歐洲有同樣的發(fā)生率,發(fā)展中國家發(fā)生率更高。盡管醫(yī)療水平和措施不斷加強,但這并沒有降低膿毒血癥的發(fā)病率和死亡率。 膿毒血癥的發(fā)病機制是侵入體內的致病微生物釋放的活性成分內毒素(即LPS,lipopolysaccharide)激活單核巨噬細胞和血管內皮細胞,啟動了宿主體內失控性炎癥反應。如果失控的炎癥因子水平持續(xù)升高,患者會經歷全身炎癥反應綜合征、中毒性休克、多器官功能衰竭甚至死亡。 LPS(lipopolysaccharide)是引起膿毒癥休克的主要致病因子。LPS可通過間接或直接兩條途徑激活組織細胞炎癥。目前針對膿毒血癥防治措施主要包括:拮抗炎癥介質的生物學活性,抑制炎癥介質的表達,阻斷炎癥反應的啟動等方面。在過去的十幾年中,人們嘗試了多種拮抗措施控制炎癥反應,包括單克隆抗體等方法,如抑制炎癥介質的活性如白介素-6、腫瘤壞死因子α等,或者阻斷信號通路后來減輕炎癥反應,但效果甚微。近年來,人們逐漸認識到如何在早期就對炎癥反應的啟動實施有效的阻抑,才是控制炎癥反應的最合理的途徑。因此探索LPS激活失控性炎癥反應中所參與的全面的分子機理,尋找中和或拮抗LPS制劑并把失控性炎癥反應控制在早期環(huán)節(jié)是目前活躍的方向。其中結合噬菌體展示肽庫篩選和改造肽制劑來拮抗LPS具有誘人的前景。 噬菌體展示肽庫技術是利用生物分子間的相互作用來篩選功能分子,它在研究蛋白質間相互作用、尋找酶和受體的激動劑和拮抗劑、研制新型診斷試劑和疫苗以及在抗腫瘤藥物研究中都有重要價值。噬菌體展示肽庫技術具有高庫容、高效方便及靈活的篩選技術等特點,使其在許多方面占有重要地位。隨著篩選靶標范圍的擴展及相應的更加完善的篩選方法的建立,噬菌體展示肽庫技術將會有更廣泛的應用,在功能基因組學、基因疫苗研究、藥物設計、尋找新配體及腫瘤導向治療方面日益顯示出強大的優(yōu)勢。在DNA改組、定向進化領域它也是非常有用的工具。本課題采用噬菌體展示技術,篩選與LPS結合的多肽,結合生物信息學推測與LPS相互作用分子位點,從蛋白結構數據庫和文獻數據庫驗證,體外活性實驗證實。為內毒素血癥的防治探索新的技術途徑。 主要技術方法: 制備兔抗LPS多克隆抗體供篩選過程檢測用。篩選實驗采用經典的親和富集法,以LPS為靶分子,對噬菌體隨機七、十二肽庫進行4輪親和篩選,獲得與LPS結合的噬菌體克隆。應用結合實驗和克隆斑抑制實驗進一步確證。挑選出結合力強的克隆,將獲得的噬菌體克隆進行DNA測序,根據噬菌體克隆基因中所插入的外源DNA序列推導出呈現(xiàn)的外源多肽氨基酸序列。應用DNASTAR軟件及其它生物信息網絡軟件如BLAST軟件將多肽序列比較分析,進行蛋白結構數據庫和文獻數據庫檢索。對獲得的多肽采用FMOC固相合成法化學合成。通過ELISA法與PMB B (polymyxin B,)對比進行了相對親和力測試實驗。體外試驗:以人單核巨噬細胞株U937細胞為模型。首先通過生長曲線法和流式細胞實驗觀察合成肽對細胞生長影響�；钚詫嶒炛懈鶕䦟嶒炘O計方案,U937細胞被分為對照組、LPS組,及P11組干預組(分為小、中、大劑量組)。進行了流式細胞檢測分析(FACS)異硫氰酸熒光素標記的LPS(FITC-LPS)與U937細胞的結合。RT-PCR和檢測U937細胞腫瘤壞死因子α(TNF-α)mRNA轉錄情況,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液測定腫瘤壞死因子α的含量。 結果: 1.制備了兔抗LPS多克隆抗體,以供篩選過程檢測用,為內毒素結合肽噬菌體克隆的篩選奠定了基礎。 2.采用親和篩選方法,以LPS為靶分子,經過4輪篩選,從噬菌體隨機7、12肽庫中獲得了可與LPS結合的噬菌體克隆。 3.從獲得LPS結合克隆中挑取160個噬菌體克隆,進行結合實驗。根據結合實驗結果挑選19(七肽庫選了12個,十二肽庫選了7個)個結合力最強的克隆進行DNA序列測序及生物信息學分析。十二肽庫篩選到的共有核心序列為CGGAGGCGGACTCTTATGAATCCACT ,七肽庫篩選到的共有核心序列為CGGAGGCGGATTCTCATGAAA,根據上述19個噬菌體克隆基因中插入的外源DNA序列推導出呈現(xiàn)的多肽序列,這19個噬菌體克隆融合多肽的核心序列為HWQWPHWSPPP,命名為P11肽。用篩選的肽的全氨基酸序列檢索專利數據庫,未發(fā)現(xiàn)申請保護這段氨基酸序列的專利。經BLAST檢索發(fā)現(xiàn)有908個蛋白質與篩選的多肽有匹配位點。這些蛋白按照功能可分為七組:炎癥反應形成相關,促凝血相關,細胞凋亡相關,細胞骨架重構相關,細胞能量代謝障礙相關,胞內信號轉導有關,及功能未明蛋白207條。有些結果驗證了一些與LPS相互作用的蛋白,如清道夫受體、巨噬細胞甘露糖受體、熱休克蛋白60、白介素27受體等,也檢索到一些以前不知道與LPS相互作用的蛋白分子,如層粘蛋白受體和鋅指蛋白等。 4.采用FMOC固相合成法成功合成了LPS結合肽HWQWPHWSPPP-NH2,并在其C端加NH2修飾以增強其穩(wěn)定性。多肽純度超過99%,得到的多肽純品進行質譜分析測定分子量為1453.8,與理論值1453.6相符,說明合成的多肽結構正確,純度合乎測試要求,可用于生物學活性的檢測與評價。 5.親和ELISA檢測結果顯示P11與LPS有親和力,在相同的質量濃度下,P11與LPS的親合力比PMB低。 6 .通過生長曲線和流式細胞學分析檢測結果,P11肽對U937細胞生長無顯著影響。利用新鮮人外周血分離單核細胞、U937細胞,通過流式細胞儀觀察到P11具有阻止FITC-LPS體外結合作用。 7.細胞因子生成抑制實驗發(fā)現(xiàn),高濃度P11(10μg/ml)可顯著抑制LPS誘導U937細胞TNFαmRNA轉錄和蛋白的表達。 結論: 1.本研究成功的從噬菌體隨機7、12肽庫中篩選獲得了可與LPS結合的噬菌體克隆。 2.篩選獲得與LPS結合的噬菌體克隆展示肽的核心序列為HWQWPHWSPPP。檢索可發(fā)現(xiàn)與體內相關蛋白質同源匹配位點。 3.應用FMOC固相法成功合成11肽HWQWPHWSPPP-NH2,命名為P11,結果證明P11對U937細胞生長無顯著影響,具有抑制LPS誘導U937分泌TNFα的活性。 上述研究結果說明從肽庫中篩選內毒素結合肽是可行的。以這些多肽為先導物設計開發(fā)或者進一步開展定向進化研究來開發(fā)靶向LPS的抗炎多肽是可能的。這為探索內毒素血癥的防治提供了新的途徑。
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【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R392

【參考文獻】

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