本文關(guān)鍵詞： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 流體剪切力 細(xì)胞骨架微絲 分化方向　出處：《重慶大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：流體剪應(yīng)力作用下,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的分化趨勢(shì)及機(jī)制被越來越多關(guān)注和研究。本實(shí)驗(yàn)室之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力同時(shí)調(diào)控了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化方向和細(xì)胞骨架F-actin的重排。本論文以此為基礎(chǔ),探討了不同速度增加的單向流體剪應(yīng)力在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中細(xì)胞骨架F-actin重組裝對(duì)該機(jī)制的調(diào)控作用,進(jìn)一步考察了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力作用下力學(xué)敏感型鈣離子通道對(duì)F-actin重組裝的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:以6周齡Sprague Dawley大鼠來源的第三、四代MSCs為實(shí)驗(yàn)研究對(duì)象,使用平板流動(dòng)腔裝置對(duì)細(xì)胞骨架固定劑鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)預(yù)處理后的MSCs施加三種不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力,即0分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10dyn/cm2、2分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10 dyn/cm2、20分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10 dyn/cm2(分別簡化為0-0’、0-2’、0-20’)。完成20分鐘力學(xué)加載并通過熒光染色即時(shí)觀察細(xì)胞骨架F-actin聚合情況并量化其熒光強(qiáng)度得到細(xì)胞骨架F-actin聚合程度的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示,Phalloidin抑制組的細(xì)胞連續(xù)F-actin的量化結(jié)果均大于靜態(tài)對(duì)照組,但均小于相同加載方式下而未進(jìn)行預(yù)處理的實(shí)驗(yàn)組,說明不同線性增加的單向流體剪應(yīng)力調(diào)控了MSCs細(xì)胞骨架F-actin的重排,且0-2’加載方式使MSCs的F-actin聚合度最大,相比之下0-20’力學(xué)刺激方式對(duì)細(xì)胞骨架F-actin聚合度影響最小。加載條件下Phalloidin不能完全抑制F-actin重排。在發(fā)現(xiàn)上述結(jié)果后,為考察細(xì)胞骨架F-actin在不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力調(diào)控MSCs分化中的作用,本文分別檢測(cè)了MSCs的成骨向(堿性磷酸酶,ALP)和軟骨向(糖胺聚糖,GAG)分化標(biāo)志物。結(jié)果表明,三種加載方式作用于MSCs20分鐘并靜態(tài)培養(yǎng)48小時(shí)后,在Phalloidin非抑制組中實(shí)驗(yàn)結(jié)果與課題組已得到的結(jié)論一致,即0-2’加載組的ALP表達(dá)最多,且與其他組包括靜態(tài)組均有顯著性差異;而0-0’加載組的GAG表達(dá)結(jié)果最大,且與其他組包括靜態(tài)組均有顯著性差異。所以我們認(rèn)為0-2’力學(xué)刺激可促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞系分化,0-0’力學(xué)刺激則可促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞系分化;而Phalloidin抑制組中三種方式的力學(xué)加載組的ALP和GAG量化結(jié)果之間均沒有顯著差異性。表明不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力通過調(diào)控細(xì)胞骨架F-actin重組進(jìn)而影響了MSCs成骨向和軟骨向分化趨勢(shì)。為進(jìn)一步探討Phalloidin試劑對(duì)MSCs分化的影響同樣使用細(xì)胞骨架F-actin穩(wěn)定劑Phalloidin預(yù)處理MSCs并完成三種方式力學(xué)加載,分別用含有和不含有Phalloidin的培養(yǎng)基靜態(tài)培養(yǎng)48小時(shí)后檢測(cè)細(xì)胞ALP及GAG的含量。我們發(fā)現(xiàn)在含有和不含有Phalloidin試劑的兩種靜態(tài)培養(yǎng)條件下,各加載組之間ALP和GAG量化結(jié)果并沒有差異性,說明Phalloidin試劑本身對(duì)細(xì)胞ALP和GAG的表達(dá)沒有影響,同時(shí)也驗(yàn)證了之前我們得到的結(jié)論,不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力通過影響細(xì)胞骨架F-actin重組進(jìn)而調(diào)控了MSCs成骨向和軟骨向分化趨勢(shì)。實(shí)驗(yàn)室前期研究已發(fā)現(xiàn),力學(xué)敏感型鈣離子通道與細(xì)胞骨架F-actin重排有著密切關(guān)系。但與MSCs的分化是否相關(guān)以及該通道是否通過F-actin重排調(diào)控MSCs分化尚不知曉。基于此,我們?cè)诹W(xué)加載前用力學(xué)敏感型鈣離子通道阻滯劑GdCl3作用MSCs以實(shí)現(xiàn)阻滯作用,20分鐘的力學(xué)加載后48小時(shí)靜態(tài)培養(yǎng),檢測(cè)MSCs骨向和軟骨向分化標(biāo)志物的表達(dá)水平。通過比較力學(xué)敏感型鈣離子通道阻滯劑作用的實(shí)驗(yàn)組和未進(jìn)行阻滯作用的實(shí)驗(yàn)組的分化標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)MSCs受到不同速度增加的單向流體剪應(yīng)力加載作用時(shí),細(xì)胞骨架F-actin的響應(yīng)有賴于力學(xué)敏感型鈣離子通道不同程度的開放。綜合上述研究結(jié)果,不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力通過MSCs力學(xué)敏感型鈣離子通道調(diào)控細(xì)胞骨架F-actin重組進(jìn)而調(diào)控其成骨向和軟骨向分化趨勢(shì)。該研究初步揭示了MSCs的在不同力學(xué)刺激下的分化調(diào)控方式及其機(jī)制,為生物力學(xué)刺激更好地在骨/軟骨損傷修復(fù)中的應(yīng)用提供參考。
[Abstract]:The mechanism of F - actin in bone marrow mesenchymal stem cells ( MSCs ) was investigated by fluorescence staining .

【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R329.2

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本文編號(hào)：1467171