本文關(guān)鍵詞：結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建和重組38kD蛋白純化及鑒定　出處：《華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)》2006年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

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【摘要】： 據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),全世界現(xiàn)有結(jié)核病人3000萬(wàn),每年新發(fā)生約900萬(wàn)例,每年死亡300萬(wàn)人。目前結(jié)核病還沒(méi)有很理想的診斷技術(shù)。結(jié)核病的診斷尤其是早期的診斷對(duì)結(jié)核病的防治有著非常關(guān)鍵的作用。結(jié)核菌38kD蛋白具有強(qiáng)免疫性,特異性高于混合蛋白制成的抗體檢測(cè)試劑,能將結(jié)核病患者與BCG接種陽(yáng)轉(zhuǎn)健康者區(qū)分開(kāi)來(lái)。38kD蛋白在結(jié)核病血清學(xué)診斷上有很好的應(yīng)用前景。 本實(shí)驗(yàn)研究目的,是通過(guò)結(jié)核分枝桿菌38kD蛋白基因克隆及大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建,以轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入大腸桿菌,誘導(dǎo)表達(dá),純化,并鑒定該蛋白,以獲得大量38kD抗原。 根據(jù)結(jié)核菌編碼38kD蛋白的基因系列,設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物,通過(guò)PCR技術(shù)從結(jié)核菌H37Rv基因組DNA擴(kuò)增出38kD蛋白基因片段,成功連接到克隆載體pMD 18-T Simple Vector。測(cè)序鑒定為正確的38kD蛋白基因;目的片段克隆到原核表達(dá)載體pET-30a中,成功構(gòu)建成帶有C端6His-tag的融合表達(dá)載體。利用化學(xué)轉(zhuǎn)化法將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3),PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性的工程菌株;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)和十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析,本試驗(yàn)成功獲得了能夠表達(dá)的工程菌株。搖瓶培養(yǎng)確定工程菌搖瓶發(fā)酵最適溫度為37℃,發(fā)酵時(shí)間最短時(shí)間為0.5h,此時(shí)可達(dá)到最大表達(dá)量。誘導(dǎo)劑IPTG最小使用濃度為0.5 mmol/L。表達(dá)方式分析發(fā)現(xiàn)該重組蛋白在大腸桿菌中主要以包涵體的形式存在。并對(duì)包涵體進(jìn)行純化純度達(dá)到90%。利用鎳瓊脂糖凝膠FF親和柱層析對(duì)重組蛋白進(jìn)行了初步的純化研究。SDS-PAGE和免疫印跡法( Western blotting )檢測(cè)表明我們獲得純化的重組38kD蛋白。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明重組38kD蛋白可被結(jié)核病病人血清識(shí)別,進(jìn)一步鑒定重組蛋白就是結(jié)核菌38kD蛋白,也說(shuō)明了重組38kD蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性,可用于結(jié)核病的免疫學(xué)診斷。 本研究獲得了能夠表達(dá)結(jié)核菌38kD蛋白的重組工程菌株,摸索出蛋白表達(dá)的合適條件,初步證實(shí)重組38kD蛋白具有良好的免疫反應(yīng)性,為結(jié)核病的免疫學(xué)診斷打下了基礎(chǔ)。
[Abstract]:TB 38 kD protein has strong immunity and specificity higher than that of mixed protein . The 38 kD protein has good application prospect in the diagnosis of tuberculosis serologic . The purpose of this experiment was to clone the 38kD protein gene of Mycobacterium tuberculosis and construct the expression vector of E . coli , introduce the gene into E . coli , induce expression , purify , and identify the protein to obtain a large amount of 38 kD antigen . coli BL21 ( DE3 ) was cloned into prokaryotic expression vector pET - 30a . The recombinant protein was cloned into prokaryotic expression vector pET - 30a . The recombinant protein was cloned into E . coli BL21 ( DE3 ) . This study has obtained the recombinant engineering strain capable of expressing the 38kD protein of mycobacterium tuberculosis , and finds out the suitable conditions for the expression of the protein , and preliminarily proves that the recombinant 38kD protein has good immunoreactivity and lays a foundation for the immunological diagnosis of tuberculosis .

【學(xué)位授予單位】：華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類(lèi)號(hào)】：R346;Q78

【引證文獻(xiàn)】

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1 王勝;Cry1Aa-CpTI融合蛋白的原核表達(dá)及其對(duì)斜紋夜蛾殺蟲(chóng)活性研究[D];海南大學(xué);2010年

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本文編號(hào)：1384137