發(fā)布時(shí)間：2017-06-15 02:13

  本文關(guān)鍵詞：健脾益肺方治療ALS動(dòng)物模型hSOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的療效和機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的：肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一類主要累及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)展性神經(jīng)變性病,目前尚無有效的治療方法。本研究擬通過不同濃度的健脾益肺方治療ALS的動(dòng)物模型hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠,通過檢測(cè)模型小鼠的運(yùn)動(dòng)功能和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的存活情況來評(píng)價(jià)健脾益肺方的療效,檢測(cè)脊髓的丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性來評(píng)價(jià)健脾益肺方的抗氧化自由基作用。為中藥組方治療ALS動(dòng)物模型的療效及作用機(jī)制提供初步的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：一、試劑和設(shè)備(一)健脾益肺方組成：黃芪9g,黨參4.5g,白術(shù)4.5g,茯苓1g,麥冬3g,陳皮0.5g,法夏0.5g,杏仁1g,射干1g,石菖蒲0.5g,白附子0.5g,僵蠶0.5g,制馬錢子0.1g,炙甘草2g。全部購(gòu)買無糖顆粒劑型,批號(hào)：YPA2L0002,購(gòu)自江陰天江藥業(yè)有限公司。(二)MDA.GSH.SOD和GSH-Px的檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；焦油紫購(gòu)自Sigma-Aldrich公司,其他普通試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。二、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組(一)hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠購(gòu)買自南京大學(xué)-南京生物醫(yī)藥研究院。(二)動(dòng)物分組：應(yīng)用8周齡的hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠共24只,按數(shù)字編號(hào)隨機(jī)分為四組,每組6只。(1)生理鹽水組(2)低濃度健脾益肺方組(2.86g／Kg)(3)中濃度健脾益肺方組(5.72g／Kg)(4)高濃度健脾益肺方組(11.44g／Kg),選同窩8周的普通野生型小鼠共6只為正常對(duì)照組,灌注生理鹽水。觀察小鼠的運(yùn)動(dòng)功能及生存期,終末期時(shí)分別取各組實(shí)驗(yàn)鼠各3只,進(jìn)行脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的尼氏染色,另每組3只進(jìn)行抗氧化自由基實(shí)驗(yàn)。三、具體實(shí)驗(yàn)步驟(一)健脾益肺組方治療后模型小鼠的體重變化每日實(shí)驗(yàn)前采用電子秤稱量模型小鼠的體重,并做好記錄。(二)健脾益肺組方治療后模型小鼠發(fā)病時(shí)間、生存期及運(yùn)動(dòng)功能的評(píng)估1.發(fā)病時(shí)間(每日評(píng)定)采用Weydt 4分法進(jìn)行評(píng)定：4分：沒有運(yùn)動(dòng)功能異常；3分：懸尾時(shí)出現(xiàn)后肢顫抖；2分：步態(tài)異常；1分：至少1個(gè)后肢出現(xiàn)拖曳；0分：將鼠翻身成仰臥位30s內(nèi)無法翻回俯臥位。發(fā)病評(píng)價(jià)：回顧性分析(超過2周),以Weydt＜4分的初始時(shí)間作為發(fā)病開始。2.生存期死亡時(shí)間：將鼠翻身為仰臥位30s內(nèi)無法翻回俯臥位即Weydt為0分,登記為死亡。3.運(yùn)動(dòng)功能(1)懸尾實(shí)驗(yàn)：懸提鼠尾,觀測(cè)后肢的伸張及其曲腰情況,并予評(píng)分。2分：正常；1分：部分正常；0分：缺失。(2)牽引實(shí)驗(yàn)：將小鼠放于30公分長(zhǎng)的鐵絲上,小鼠5分鐘內(nèi)掉落的次數(shù)(小鼠掉落后,立刻將其放置鐵絲上繼續(xù)實(shí)驗(yàn))。(3)跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)：將小鼠放在疲勞轉(zhuǎn)棒儀上,以轉(zhuǎn)速16圈／分鐘連續(xù)5分鐘,登記每組小鼠的平均掉棒次數(shù)(小鼠掉棒后,立即將其放置回疲勞轉(zhuǎn)棒儀上繼續(xù)實(shí)驗(yàn))。(三)健脾益肺組方治療后的病理改變應(yīng)用4%的多聚甲醛經(jīng)心臟灌注,后固定24小時(shí),蔗糖梯度脫水,用OCT包埋,取脊髓的腰段進(jìn)行冰凍切片(切片厚度20μm),每隔3片取1片。應(yīng)用焦油紫進(jìn)行尼氏染色。前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：具有清晰可辨的尼氏結(jié)構(gòu),清晰的細(xì)胞核和核仁,胞體較大的多角細(xì)胞。(四)健脾益肺組方治療機(jī)制的探討抗氧化自由基：硫代巴比妥酸法檢測(cè)MDA的含量；亞硝酸鹽法測(cè)定SOD的活性；二硫代二硝基苯甲酸法測(cè)定GSH的含量；二硝基苯甲酸法測(cè)定GSH-Px的活性,按照試劑盒說明書操作。結(jié)果：1.體重的變化8周齡模型小鼠開始進(jìn)行體重測(cè)定,第8-12周各組間的體重?zé)o顯著性差異,至第12周開始,生理鹽水組模型小鼠體重開始減輕,低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠體重仍緩慢增加；第13周開始,低濃度、中濃度健脾益肺方治療組模型小鼠體重也開始下降,而高濃度組模型小鼠體重仍在緩慢增加；約15周開始,高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠體重開始下降,同生理鹽水組模型小鼠比較,低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠體重下降趨勢(shì)較慢,且呈濃度正相關(guān)性。低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2.對(duì)發(fā)病時(shí)間和生存期的影響生理鹽水組的模型小鼠在(101.5±3.45)天出現(xiàn)臨床癥狀,即Weydt 4分法,評(píng)分4分時(shí)(為發(fā)病時(shí)間),模型小鼠在病程中會(huì)出現(xiàn)后肢無力,懸尾時(shí)后肢震顫、后伸乏力的表現(xiàn),至終末期時(shí)雙側(cè)后肢呈牽直樣強(qiáng)直、背部屈曲,終因飲食艱難、呼吸無力而死亡,平均存活時(shí)間為(133.2±2.32)天。低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠的發(fā)病時(shí)間分別為(103.3±2.16)天、(109.5±1.87)天、(112±3.03)天,低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠的生存期分別為(134.3±1.86)天, (140.2±2.32)天,(147.8±1.17)天,低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠較生理鹽水組模型小鼠的生存時(shí)間延長(zhǎng),差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.運(yùn)動(dòng)功能：牽引實(shí)驗(yàn)：同一時(shí)期不同濃度健脾益肺方治療組模型小鼠的墜落次數(shù)并不一樣,健脾益肺方治療組的模型小鼠較生理鹽水組模型小鼠明顯耐受性好,且呈濃度正相關(guān)性,低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中濃度、高濃度健脾益肺方組模型小鼠同生理鹽水組模型小鼠比較差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)跑臺(tái)實(shí)驗(yàn)：同期中,健脾益肺方治療組的模型小鼠較生理鹽水組模型小鼠墜落明顯減少,同樣呈濃度正相關(guān)性：低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠同生理鹽水組模型小鼠比較差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。4.脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的計(jì)數(shù)隨著鼠齡的增長(zhǎng),模型小鼠的腰段脊髓前角病變的神經(jīng)元會(huì)逐步出現(xiàn)尼氏體不清、變性,核固縮,細(xì)胞體積減小,細(xì)胞萎縮,數(shù)量減少,整個(gè)脊髓前角外形萎縮,病變隨時(shí)間延長(zhǎng)而進(jìn)行性加重。終末期取生理鹽水組、陰性對(duì)照組、低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方治療組病理切片尼氏染色。生理鹽水治療組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)為(3.86±1.215)個(gè)／視野,低濃度、中濃度、高濃度健脾益肺方組分別為(4.00±0.816)個(gè)/視野, (4.57±0.976)個(gè)/視野, (7.57±0.976)個(gè)/視野,陰性對(duì)照組運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元計(jì)數(shù)為(9.82±0.216)個(gè)/視野。低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)；高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；陰性對(duì)照組小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)5.谷胱甘肽(GSH)的含量、谷胱甘肽過氧化物酶(GH-Px)的活性、超氧化物歧化酶(SOD)活力、丙二醛(MDA)的含量生理鹽水組模型小鼠的GSH、GSH-PX、SOD值最低,MDA值最高；陰性對(duì)照組小鼠的GSH、GSH-PX、SOD值最高,MDA值最低。健脾益肺方組模型小鼠的GSH、GSH-PX、 SOD值隨著濃度的增高而增高,MDA值隨著濃度增高而減低。低濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠比較,不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中濃度、高濃度健脾益肺方治療組模型小鼠與生理鹽水組模型小鼠相比,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)；陰性對(duì)照組小鼠與生理鹽水組模型小鼠相比,差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。結(jié)論：中濃度、高濃度健脾益肺方延緩hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的體重下降,延緩hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病時(shí)間,增加hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠存活天數(shù),改善hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的運(yùn)動(dòng)功能,可能是通過中濃度、高濃度健脾益肺方提高抗氧化能力,降低氧化自由基損傷,達(dá)到了保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞目的,延緩了神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程,從而使疾病的進(jìn)展變得緩慢。本研究采用ALS的經(jīng)典模型hSODl-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行中藥的療效及機(jī)制研究,為中藥治療ALS提供了動(dòng)物模型研究依據(jù)。應(yīng)用不同濃度的健脾益肺方治療ALS,對(duì)健脾益肺方的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討,為健脾益肺方治療ALS提供了初步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：健脾益肺方 肌萎縮側(cè)索硬化 SOD1-G93A轉(zhuǎn)基因小鼠
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R277.7;R-332
【目錄】：

• 摘要3-7
• Abstract7-14
• 引言14-16
• 第一章 研究背景16-26
• 第一節(jié) 肌萎縮側(cè)索硬化的西醫(yī)研究現(xiàn)狀16-19
• 一、ALS的流行病學(xué)特點(diǎn)16
• 二、ALS的病因和發(fā)病機(jī)制16-17
• 三、SOD1突變基因與ALS17-18
• 四、氧化應(yīng)激與ALS18
• 五、ALS的治療18-19
• 第二節(jié) 肌萎縮側(cè)索硬化的中醫(yī)研究現(xiàn)狀19-22
• 一、ALS的中醫(yī)病名19-20
• 二、ALS的中醫(yī)病因病機(jī)20
• 三、ALS的中醫(yī)治療20-21
• 四、健脾益肺方在臨床中的運(yùn)用21-22
• 第三節(jié) 健脾益肺方的中醫(yī)方解及現(xiàn)代藥理22-25
• 一、中醫(yī)方解22
• 二、方中組成的藥理22-25
• 第四節(jié) ALS的動(dòng)物模型25
• 第五節(jié) 研究目的和意義25-26
• 第二章 實(shí)驗(yàn)研究26-43
• 第一節(jié) 實(shí)驗(yàn)試劑與材料26-27
• 一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物26
• 二、主要試劑26-27
• 三、主要儀器27
• 第二節(jié) 試劑的配制27-30
• 一、中藥組方的配制27-28
• 二、普通試劑配制28
• 三、SOD、MDA、GSH、GSH-PX試劑盒配制28-30
• 第三節(jié) 實(shí)驗(yàn)具體操作30-33
• 一、動(dòng)物分組與給藥30
• 二、體重變化30
• 三、發(fā)病時(shí)間及生存期觀察30
• 四、運(yùn)動(dòng)功能30-31
• 五、組織學(xué)方法31-33
• 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理33
• 第四節(jié) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果33-43
• 一、體重變化33-34
• 二、發(fā)病時(shí)間及生存期觀察34
• 三、運(yùn)動(dòng)情況34
• 四、脊髓前角細(xì)胞34-35
• 五、抗氧化自由基35-43
• 討論43-49
• 結(jié)語(yǔ)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-52
• 附錄52-53
• 在校期間發(fā)表論文情況53-54
• 致謝54-55
• 附件55

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本文編號(hào)：451199