金黃色葡萄球菌作為人類重要的致病菌,能引起多種感染。附屬基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)作為毒力因子的調(diào)控系統(tǒng),在其致病過程中發(fā)揮著重要作用。該系統(tǒng)包含一個雙組份信號轉導系統(tǒng)（AgrC/AgrA）,AgrC負責感知外源信號刺激并將信號傳遞到胞內(nèi)的AgrA,磷酸化后的AgrA可以特異性的與下游啟動子P2P3之間的序列結合,并進而引起相關毒力因子的表達與釋放。體外研究表明,AgrA異源表達過程中,往往在獲得高水平表達的同時,容易被宿主蛋白酶降解或者形成包涵體,不利于目的蛋白功能活性的研究。并且,膜蛋白AgrC在細胞膜上具有拓撲取向性,使得在體外研究雙組份信號轉導系統(tǒng)變得更加困難。因此,欲對金黃色葡萄球菌雙組份信號轉導系統(tǒng)的研究,首先需要解決AgrA可溶性表達的問題和AgrC在人工膜中的取向問題。該研究將為體外篩選和開發(fā)抗金黃色葡萄球菌感染的新藥奠定一定基礎。首先,采用無限制克隆法構建AgrA表達載體,在AgrA蛋白的C端融合綠色熒光蛋白（GFP）標簽,通過實時監(jiān)測GFP的熒光強度來快速檢測重組蛋白的表達水平。利用單因素實驗篩選出宿主菌株;然后,結合Box-Behnken試驗設計,篩選出最優(yōu)蛋白表達條件。其次,... 

【文章頁數(shù)】：71 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 金黃色葡萄球菌的耐藥性
    1.2 細菌群體感應系統(tǒng)
        1.2.1 細菌群體感應系統(tǒng)簡介
        1.2.2 金黃色葡萄球菌群體感應系統(tǒng)
        1.2.3 AgrC
        1.2.4 AgrA
        1.2.5 AIP信號分子
    1.3 人工細胞膜體系簡介
        1.3.1 脂質(zhì)體
        1.3.2 蛋白脂質(zhì)體
    1.4 本研究工作的內(nèi)容和意義
第二章 金黃色葡萄球菌反應調(diào)節(jié)蛋白AgrA的表達與純化
    2.1 引言
    2.2 實驗材料
        2.2.1 實驗菌株與質(zhì)粒
        2.2.2 主要儀器與設備
        2.2.3 主要試劑與規(guī)格
        2.2.4 培養(yǎng)基與溶液配制
    2.3 實驗方法
        2.3.1 表達載體的構建
        2.3.2 AgrA-GFP蛋白異源表達體系的優(yōu)化
        2.3.3 GFP熒光測定
        2.3.4 AgrA-GFP與AgrA蛋白的純化
        2.3.5 SDS-PAGE電泳與Western blot檢測
    2.4 結果與討論
        2.4.1 重組表達載體pET-28a(+)-AgrA和pET-28a(+)-AgrA-GFP的構建
        2.4.2 表達菌株的篩選
        2.4.3 Box-Behnken 設計法優(yōu)化蛋白表達條件
        2.4.4 AgrA-GFP和AgrA蛋白的表達與純化
        2.4.5 討論
第三章 受體蛋白AgrC跨膜鑲嵌的人工細胞膜體系的構建及其評價
    3.1 引言
    3.2 實驗材料
        3.2.1 實驗菌株
        3.2.2 主要儀器與設備
        3.2.3 主要試劑與規(guī)格
        3.2.4 培養(yǎng)基與溶液配制
    3.3 實驗方法
        3.3.1 蛋白的表達與純化
        3.3.2 脂質(zhì)體的制備
        3.3.3 脂質(zhì)體的表征
        3.3.4 蛋白脂質(zhì)體的制備
        3.3.5 AgrC蛋白脂質(zhì)體中AgrC取向分析
    3.4 結果與討論
        3.4.1 最佳緩沖體系的篩選
        3.4.2 帶負電磷脂比例和膽固醇含量對脂質(zhì)體穩(wěn)定性的影響
        3.4.3 最佳鑲嵌比例的確定
        3.4.4 蛋白脂質(zhì)體中AgrC取向分析
        3.4.5 討論
第四章 AgrC/AgrA雙組份信號轉導模型的構建與EMSA評價
    4.1 引言
    4.2 實驗材料
        4.2.1 主要儀器與設備
        4.2.2 主要試劑與規(guī)格
    4.3 實驗方法
        4.3.1 AgrA蛋白活性檢測
        4.3.2 AgrC激酶活性的測定
        4.3.3 AgrC/AgrA雙組份信號轉導模型的構建
        4.3.4 啟動子P2P3核心序列的復性
        4.3.5 AgrC/AgrA雙組份信號轉導模型的EMSA檢測
    4.4 結果與討論
        4.4.1 AgrA蛋白活性的檢測
        4.4.2 AgrC蛋白活性的驗證
        4.4.3 復性后P2P3核心序列的檢測
        4.4.4 AgrC/AgrA雙組份信號轉導模型的EMSA檢測
        4.4.5 AgrC對EMSA實驗的影響
        4.4.6 討論
第五章 總結與展望
    5.1 結論
    5.2 展望
參考文獻
攻讀碩士學位期間發(fā)表論文情況
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]不同電性脂質(zhì)體對金黃色葡萄球菌組氨酸激酶AgrC跨膜鑲嵌效率的影響[J]. 熊文,權春善,王麗娜,張旭寧,趙晶,鄭維,范圣第.  高等學�；瘜W學報. 2014(09)
[2]外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達策略[J]. 朱紅裕,李強.  過程工程學報. 2006(01)
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[8]在大腸桿菌表達體系中以包涵體形式存在的真核生物蛋白質(zhì)的分離、復性和二硫鍵的形成[J]. 陳來同,茹炳根.  中國生化藥物雜志. 1997(01)

碩士論文
[1]脂質(zhì)體Na+、K+Gibbs-Donnan平衡與振蕩現(xiàn)象[D]. 晏芳.浙江工商大學 2008



本文編號：3711947