目的利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)抑制腸出血性大腸埃希菌（EHEC）O157∶H7StxⅡ基因表達(dá),并評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的影響及細(xì)胞毒性。方法針對(duì)EHEC O157∶H7StxⅡ基因設(shè)計(jì)引物,構(gòu)建CRISPR/Cas9表達(dá)質(zhì)粒pdCas9-StxⅡ并轉(zhuǎn)化EHEC O157∶H7感受態(tài)細(xì)胞,采用RT-PCR及膠體金法檢測(cè)StxⅡ基因表達(dá)情況,繪制菌株生長(zhǎng)曲線,將菌株培養(yǎng)上清液接種Vero細(xì)胞觀察細(xì)胞病變情況。結(jié)果測(cè)序分析顯示pdCas9-StxⅡ表達(dá)質(zhì)粒被成功構(gòu)建;轉(zhuǎn)化EHEC O157∶H7（00G097）感受態(tài)細(xì)胞后,StxⅡ基因mRNA、蛋白表達(dá)均受抑制,EHEC O157∶H7生長(zhǎng)曲線未受影響（P值均>0.05）。pdCas9-StxⅡ-00G097菌株培養(yǎng)上清液對(duì)細(xì)胞的毒性效應(yīng)（CPE為30%）顯著低于對(duì)照菌株00G097和pdCas9-00G097（CPE均>80%）。結(jié)論成功構(gòu)建的pdCas9-StxⅡ表達(dá)質(zhì)粒能特異抑制EHEC O157∶H7StxⅡ基因表達(dá)、降低細(xì)胞毒性,為進(jìn)一步研究志賀毒素StxⅡ在EHEC O157∶H7致病機(jī)理和基因工程減毒活菌苗... 

【文章來(lái)源】：江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué). 2016,27(05)

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圖２ＰＣＲ法檢測(cè)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株中ＳｔｘＩＩｍＲＮＡ表達(dá)水平電泳圖

基因的ｍＲＮＡ表達(dá)被抑制。見圖２。２．４ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９質(zhì)粒對(duì)菌株生長(zhǎng)的影響繪制陰性對(duì)照００Ｇ０９７菌株、ｐｄＣａｓ９－００Ｇ０９７和ｐｄＣａｓ９－ＳｔｘＩＩ－００Ｇ０９７菌株在ＬＢ培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線。３株細(xì)菌在各測(cè)試點(diǎn)生長(zhǎng)速率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Ｐ值均＞０．０５），表明抑制ＳｔｘＩＩ基因表達(dá)對(duì)菌株的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。見圖３。圖２ＰＣＲ法檢測(cè)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株中ＳｔｘＩＩｍＲＮＡ表達(dá)水平電泳圖圖３電轉(zhuǎn)化后３菌株生長(zhǎng)曲線２．５膠體金檢測(cè)ＳｔｘＩＩ蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照００Ｇ０９７菌株、ｐｄＣａｓ９－００Ｇ０９７菌株均可檢出ＳｔｘＩＩ蛋白，而ｐｄＣａｓ９－ＳｔｘＩＩ－００Ｇ０９７菌株中未檢測(cè)到ＳｔｘＩＩ蛋白，表明該菌株中ＳｔｘＩＩ基因表達(dá)被成功抑制。圖４膠體金法檢測(cè)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株ＳｔｘＩＩ蛋白表達(dá)·５２２·江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)２０１６年９月第２７卷第５期ＪｉａｎｇｓｕＪＰｒｅｖＭｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０１６，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．５

均＞０．０５），表明抑制ＳｔｘＩＩ基因表達(dá)對(duì)菌株的生長(zhǎng)無(wú)顯著影響。見圖３。圖２ＰＣＲ法檢測(cè)ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株中ＳｔｘＩＩｍＲＮＡ表達(dá)水平電泳圖圖３電轉(zhuǎn)化后３菌株生長(zhǎng)曲線２．５膠體金檢測(cè)ＳｔｘＩＩ蛋白表達(dá)結(jié)果顯示，陰性對(duì)照００Ｇ０９７菌株、ｐｄＣａｓ９－００Ｇ０９７菌株均可檢出ＳｔｘＩＩ蛋白，而ｐｄＣａｓ９－ＳｔｘＩＩ－００Ｇ０９７菌株中未檢測(cè)到ＳｔｘＩＩ蛋白，表明該菌株中ＳｔｘＩＩ基因表達(dá)被成功抑制。圖４膠體金法檢測(cè)不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株ＳｔｘＩＩ蛋白表達(dá)·５２２·江蘇預(yù)防醫(yī)學(xué)２０１６年９月第２７卷第５期ＪｉａｎｇｓｕＪＰｒｅｖＭｅｄ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０１６，Ｖｏｌ．２７，Ｎｏ．５

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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