本文關鍵詞：HIPPO信號通路在小鼠原始卵泡啟動中的作用及調(diào)控機制，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的:闡明原始卵泡啟動的分子機制對于防治女性不孕癥和卵巢早衰具有重要意義。我們的前期研究表明HIPPO信號通路存在于小鼠卵巢,且與原始卵泡池大小具有時序相關性,然其具體作用及調(diào)控機制尚不清楚。本課題通過進一步探究HIPPO信號通路在原始卵泡啟動過程中的表達、作用及其調(diào)控機制,為進一步了解原始卵泡啟動與靜息狀態(tài)維持的分子機制增添新資料。方法:1.建立小鼠原始卵泡體外培養(yǎng)模型,利用免疫熒光、Western blot檢測3 d小鼠卵巢體外培養(yǎng)8 d后HIPPO通路主要組分MST1、LATS2和YAP1的定位及表達變化。2.構建HIPPO信號通路主要效應分子YAP1基因慢病毒載體:(1)YAP1慢病毒過表達載體(Vector-YAP1)和陰性對照載體(Vector)。(2)YAP1慢病毒干擾載體(sh YAP1-1、sh YAP1-2、sh YAP1-3)和陰性對照載體(sh Control)。3.利用免疫熒光和Western blot鑒定篩選YAP1沉默效果最強的慢病毒載體。4.Vector-YAP1和sh YAP1慢病毒載體分別轉染3 d小鼠卵巢,HE染色和Western blot觀察上調(diào)/下調(diào)YAP1對小鼠原始卵泡啟動、生長的影響,同步檢測信號分子AKT表達變化。5.AKT特異性抑制劑MK2206-2HCl添加于原始卵泡體外培養(yǎng)體系中,觀察AKT下調(diào)對原始卵泡啟動的影響,同步檢測HIPPO通路主要組分如MST1、LATS2和YAP1的表達變化。6.將YAP1高表達慢病毒載體加入MK2206-2HCl孵育的原始卵泡體外培養(yǎng)體系,觀察YAP1上調(diào)在AKT下調(diào)對原始卵泡啟動影響中的作用。結果:1.免疫熒光結果顯示:HIPPO信號通路主要組分MST1、P-MST、LATS2、YAP1和P-YAP1在3 d和3 d培養(yǎng)8 d后小鼠卵巢中均有表達,且MST1與LATS2共表達于小鼠卵巢。在原始卵泡中,MST1表達于卵母細胞質;P-MST表達于卵母細胞質、細胞核及顆粒細胞;LATS2表達于卵母細胞質、細胞核;YAP1和P-YAP1均表達于卵母細胞質。在初級卵泡中,MST1表達于卵母細胞質和顆粒細胞;P-MST表達于卵母細胞質、細胞核及顆粒細胞;LATS2表達于卵母細胞質和顆粒細胞;YAP1和P-YAP1均表達于卵母細胞質、細胞核及顆粒細胞。Western blot結果顯示:3 d小鼠卵巢培養(yǎng)8 d后,MST1、P-MST、LATS2蛋白表達均顯著減少(p0.05,p0.01,p0.001);YAP1、P-YAP1蛋白表達顯著增加(p0.01,p0.01);P-MST/MST1、P-YAP1/YAP1比值顯著減少(p0.05,p0.05)。表明,隨著小鼠原始卵泡啟動HIPPO通路主要組分MST1、LATS2和YAP1表達量發(fā)生顯著變化,暗示原始卵泡啟動與HIPPO通路活性衰減密切相關。2.構建HIPPO信號通路主要效應分子YAP1基因慢病毒載體。Western blot和免疫熒光檢測結果顯示:YAP1慢病毒過表達載體、干擾載體和陰性對照載體均可有效轉染小鼠卵巢組織。3.篩選YAP1抑制效果最強的慢病毒載體:相對于Vector組,Vector-YAP1組YAP1蛋白表達水平顯著增加(p0.05);相對于sh Control組,sh YAP1-1、sh YAP1-2、sh YAP1-3組YAP1蛋白表達水平顯著減少(p0.05,p0.01,p0.001),且以sh YAP1-3組抑制效果最為顯著,故選擇sh YAP1-3組為最佳YAP1干擾組,記為sh YAP1組。4.Vector-YAP1和sh YAP1慢病毒載體分別轉染3 d小鼠卵巢。HE染色結果顯示:相較于Vector組,Vector-YAP1組原始卵泡數(shù)顯著減少(p0.05),初級卵泡數(shù)顯著增加(p0.05);相較于sh Control組,sh YAP1組原始卵泡數(shù)增加(p0.05),初級卵泡數(shù)顯著減少(p0.05)。表明,HIPPO通路主要效應分子YAP1活性變化可顯著影響原始卵泡啟動過程。5.Western blot結果顯示:YAP1過表達或抑制對AKT磷酸化水平無顯著影響(p0.05)。AKT特異性抑制劑MK2206-2HCl添加于原始卵泡體外培養(yǎng)體系,相較于Control組,MK2206組AKT、MST1和YAP1總蛋白表達水平無顯著變化(p0.05),而P-AKT/AKT和P-MST/MST1比值顯著減少(p0.05,p0.01),P-YAP1/YAP1比值顯著增加(p0.05)。表明,HIPPO通路位于AKT調(diào)控通路下游。6.HE結果顯示:相較于Control組,MK2206組原始卵泡數(shù)顯著增加(p0.01),初級卵泡數(shù)顯著減少(p0.05)。在MK2206+Vector-YAP1組(將YAP1高表達慢病毒載體加入MK2206組)中,原始卵泡數(shù)目顯著高于Control組(p0.05),但少于MK2206組(p0.05);初級卵泡數(shù)目顯著低于Control組(p0.05),但高于MK2206組(p0.05)。表明,AKT下調(diào)可抑制原始卵泡啟動,通過上調(diào)YAP可部分反轉其抑制作用。結論:1.HIPPO通路是調(diào)控小鼠原始卵泡靜息/啟動的重要信號通路。2.HIPPO通路參與AKT信號分子調(diào)控原始卵泡啟動。
【關鍵詞】：HIPPO YAP1 AKT 小鼠 原始卵泡
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R321
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 中英文縮略詞表12-13
• 第1章 引言13-16
• 第2章 材料與方法16-25
• 2.1 材料16-19
• 2.1.1 實驗動物16
• 2.1.2 主要試劑16-18
• 2.1.3 主要儀器18-19
• 2.2 方法19-25
• 2.2.1 原始卵泡的體外培養(yǎng)19
• 2.2.2 石蠟切片制作19
• 2.2.3 HE染色19-20
• 2.2.4 免疫熒光20
• 2.2.5 Western blot20-21
• 2.2.6 慢病毒轉染21-24
• 2.2.7 AKT特異性抑制劑MK2206孵育卵巢組織24
• 2.2.8 統(tǒng)計分析24-25
• 第3章 結果25-35
• 3.1 HIPPO信號通路中主要分子MST1，P-MST，，LATS2，YAP1和P-YAP1在小鼠原始卵泡啟動前后表達及分布變化25-29
• 3.2 YAP1慢病毒載體的構建、鑒定及篩選29-31
• 3.3 YAP1上/下調(diào)對小鼠原始卵泡啟動生長的影響31-32
• 3.4 HIPPO信號通路在AKT調(diào)控原始卵泡啟動中的作用32-35
• 第4章 討論35-39
• 4.1 包括組織密度梯度在內(nèi)的多種機制參與原始卵泡啟動的調(diào)控35
• 4.2 由組織密度梯度改變活化的HIPPO信號通路是調(diào)控原始卵泡啟動的關鍵因子35-36
• 4.3 AKT是活化HIPPO信號通路的上游激活因子36-37
• 4.4 PI3K-AKT信號通路與HIPPO信號通路存在多種信號分子間的交叉相互作用37-38
• 4.5 HIPPO信號通路可作為卵巢功能異常治療的重要靶標38-39
• 第5章 結論與展望39-40
• 5.1 結論39
• 5.2 展望39-40
• 致謝40-41
• 參考文獻41-45
• 攻讀學位期間的研究成果45-46
• 綜述46-56
• 參考文獻53-56

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：339551