本文關(guān)鍵詞：細胞程序性壞死在宿主防御病原體中的作用和調(diào)控機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【研究背景和意義】病原體誘導的細胞死亡是哺乳動物防御系統(tǒng)的一個至關(guān)重要的部分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RIP3依賴的細胞程序性壞死參與到了機體防御外來入侵病原體的過程中,但病原體激活RIP3依賴的細胞程序性壞死的具體分子機制尚不清楚。【研究目的】探究HSV-1誘導細胞程序性壞死的分子機制,以及這種程序性壞死方式如何在機體抗病毒中發(fā)揮作用�！狙芯糠椒ā繛榱撕Y選能夠引發(fā)RIP3-依賴性細胞壞死的病毒,我們利用兩株牛痘病毒和兩株HSV-1感染W(wǎng)T和RIP3缺失的MEF細胞,檢測細胞的存活率;為了檢測了RIP3的缺失是否影響了病毒的入侵和復制,用HSV-1感染了野生型和RIP3缺失的MEF細胞,之后通過蛋白免疫印跡和熒光定量PCR檢測病毒蛋白和基因的表達水平。為了檢測RIP3缺失對NF-κB信號通路的影響,利用蛋白免疫印跡檢測MEF細胞和RIP3缺失的MEF細胞感染HSV-1后p-IκBα水平;為了檢測TNFR,TLR3,Nectin-1,MLKL,CYLD和DAI是否參與到這條信號通路,通過對TNFR1 KO,TNFR1/2 DKO,TLR3 KO細胞感染HSV-1檢測存活率,通過RNAi沉默Nectin-1,CYLD后感染HSV-1檢測存活率,通過構(gòu)建MLKL shRNA細胞系和通過CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建DAI KO細胞系,感染HSV-1后檢測存活率;在RIP3缺失的MEF細胞上構(gòu)建能穩(wěn)定表達HA和Flag標簽的RIP3的細胞系,對細胞感染病毒后,利用RIP3的免疫共沉淀,將產(chǎn)物進行質(zhì)譜分析去尋找參與激活HSV-1誘導的細胞壞死的關(guān)鍵作用蛋白;通過逆轉(zhuǎn)錄病毒體系使ICP6在細胞內(nèi)過表達以檢測ICP6蛋白的表達是否足以激活RIP3/MLK依賴的細胞壞死;對野生型小鼠和和RIP3 KO小鼠腹腔注射HSV-1,檢測小鼠腦,脾,肝,血清中的病毒滴度,對小鼠肝臟進行切片及免疫組化,對小鼠注射一次或兩次病毒后,監(jiān)控存活率,以此確定RIP3在小鼠抵御病毒復制和致病中的作用。【研究結(jié)果】(1)HSV-1的感染激活RIP3-依賴性細胞壞死(2)細胞凋亡不參與到HSV-1激活的細胞死亡(3)RIP3的缺失不影響HSV-1入侵細胞以及病毒自身的復制(4)RIP3的缺失不影響HSV-1激活的NF-κB信號活性(5)HSV-1感染誘發(fā)的細胞程序性壞死不依賴TNFR,CYLD,TLR3,但依賴于Nectin-1(6)HSV-1感染誘發(fā)的細胞程序性壞死不依賴于DAI(7)MLKL是HSV-1感染誘發(fā)的細胞程序性壞死依賴于RIP3的底物MLKL(8)病毒蛋白ICP6參與到HSV-1激活的RIP3免疫復合體中(9)ICP6與RIP3通過RIP同源作用域(RHIM)相互作用(10)ICP6對于HSV-1誘導的細胞程序性壞死是必須的(11)ICP6的表達足以激活RIP3/MLKL介導的細胞程序性壞死(12)ICP6激活的細胞程序性壞死依賴于ICP6和RIP3的RHIM結(jié)構(gòu)域及RIP3的激酶活性(13)RIP3介導的細胞程序性壞死幫助機體抵御HSV-1(14)RIP3介導的細胞程序性壞死幫助宿主抵抗HSV-1的復制和造成的致死【結(jié)論】綜上所述,我們的工作首次發(fā)現(xiàn)了RIP3識別HSV-1病毒ICP6進而啟動宿主細胞程序性壞死的分子機制,并揭示了RIP3-依賴性細胞壞死在機體抗HSV-1病毒感染中的重要生理學功能。
【關(guān)鍵詞】：細胞程序性壞死 HSV-1 ICP6 RIP3 MLKL
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R329.25
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-8
• 縮略表8-10
• 前言10-13
• 材料與方法13-23
• 一．材料13-17
• 二．方法17-23
• 結(jié)果23-45
• 1．HSV-1 感染激活RIP3-依賴性細胞壞死23-25
• 2. 細胞凋亡不參與到HSV-1 激活的細胞死亡25-26
• 3. RIP3的缺失不影響HSV-1 入侵細胞以及病毒自身的復制26-27
• 4. RIP3的缺失不影響HSV-1 激活的NF-κB信號活性27-28
• 5. HSV-1 感染誘發(fā)的細胞程序性壞死不依賴TNFR，CYLD，，TLR3，但依賴于Nectin-128-30
• 6. HSV-1 感染誘發(fā)的細胞程序性壞死不依賴于DAI30-32
• 7. HSV-1 感染誘發(fā)的細胞程序性壞死依賴于RIP3的底物MLKL32-33
• 8. 病毒蛋白ICP6參與到HSV-1 激活的RIP3免疫復合體中33-34
• 9. ICP6與RIP3通過RIP同源作用域(RHIM)相互作用34-36
• 10. ICP6對于HSV-1 誘導的細胞程序性壞死是必須的36-38
• 11. ICP6的表達足以激活RIP3/MLKL介導的細胞程序性壞死38-40
• 12. ICP6激活的細胞程序性壞死依賴于ICP6和RIP3的RHIM結(jié)構(gòu)域及RIP3的激酶活性40-42
• 13. RIP3介導的細胞程序性壞死幫助機體抵御HSV-142-43
• 14. RIP3介導的細胞程序性壞死幫助宿主抵抗HSV-1 的復制和造成的致死43-45
• 討論45-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻49-53
• 綜述 細胞程序性壞死的最新研究進展53-62
• 綜述參考文獻58-62
• 攻讀學位期間本人出版和公開發(fā)表的論著、論文62-63
• 致謝63-64

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本文編號：336767