摘要：同源重組介導(dǎo)的基因定點(diǎn)整合以及原位修復(fù)是比較理想的基因編輯方式。但是由于細(xì)胞中內(nèi)在的同源重組效率很低,所以這兩種策略的應(yīng)用在研究中還并不普及。類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases, TALENs）的出現(xiàn),可能會(huì)大幅度推進(jìn)這類定點(diǎn)基因編輯技術(shù)的發(fā)展。本研究在以往研究的基礎(chǔ)上,探討TALENs以及我們自主設(shè)計(jì)改造的類轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物切口酶（Transcription activator-like effector nickases, TALENickases）在促進(jìn)細(xì)胞同源重組效率方面的作用。第一章TALE酶促進(jìn)rDNA區(qū)定點(diǎn)整合研究目的：探索TALENs和TALENickases促進(jìn)多拷貝rDNA位點(diǎn)轉(zhuǎn)基因定點(diǎn)整合的能力及其細(xì)胞毒性方面的區(qū)別,以評(píng)估TALE酶應(yīng)用于rDNA區(qū)基因打靶的可行性。方法：（1）為了在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后實(shí)時(shí)觀察定點(diǎn)整合效率,我們構(gòu)建了一個(gè)能夠?qū)o(wú)啟動(dòng)子GFP序列定點(diǎn)靶入rDNA區(qū)的基因打靶載體；（2）我們將該打靶載體聯(lián)合TALENs或者TALENickases表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染... 

【文章來(lái)源】：中南大學(xué)湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

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【學(xué)位級(jí)別】：博士

【部分圖文】：

PI復(fù)染檢測(cè)細(xì)胞調(diào)亡如圖所示，與三種TALENickases相比，TALENs具有顯著高的細(xì)胞毒性

donor vector pHniF9 Z =t- mES-Neo H efi-fix ^^H Homologous RecombinationPol I _F1?taraeted allele p 10.3 kb Pvun Pvun圖l-5pHmF9基因打把示意圖該栽體總共含有5.6kb的同源序列，可將無(wú)啟動(dòng)子的IRES-Neo表達(dá)框以及完整的EFl-HX表達(dá)框定點(diǎn)入到rDNA的5468位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)使用pHmF9對(duì)HT1080細(xì)胞進(jìn)行了核轉(zhuǎn)，同時(shí)也使用pHmF9聯(lián)合上述所有的TALENs/TALENickases組合進(jìn)行了基因打祀。在克隆篩選12天后挑取了一部分克隆進(jìn)行初步的PCR檢測(cè)，剩余的克隆用Giemsa染液染色用于拍照和計(jì)數(shù)(圖1-6)。

圖1 -1 pHmF9聯(lián)合TALENs/TALENickases打把HT1080抗性克隆鑒定A,使用引物Sreen-EC和Sreen-DN進(jìn)行PCR檢測(cè)，定點(diǎn)整合克隆可?T增出一條1.4kb的條帶，而未發(fā)生定點(diǎn)整合的克隆不能擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物；B,使用方法部分標(biāo)記的探針通過(guò)Southern blot對(duì)PCR陽(yáng)性的克隆進(jìn)行檢測(cè)，定點(diǎn)整合的克隆理論上能夠檢測(cè)到一條10.3kb的條帶，同時(shí)無(wú)論是定點(diǎn)整合克隆還是未轉(zhuǎn)染的HT1080細(xì)胞都會(huì)固定地檢測(cè)到一條4.3kb的條帶；C,通過(guò)PCR、Southern blot以及抗性克隆數(shù)計(jì)算出每個(gè)組合的基因打把效率，并根據(jù)三次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)繪制柱狀圖。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]Efficient and Specific Modifications of the Drosophila Genome by Means of an Easy TALEN Strategy[J]. Jiyong Liu~a,Changqing Li~a,Zhongsheng Yu~a,Peng Huang~b,Honggang Wu~a,Chuanxian Wei~a, Nannan Zhu~a,Yan Shen~b,Yixu Chen~a,Bo Zhang~b,Wu-Min Deng~(c,*),Renjie Jiao~(a,*) a State Key Laboratory of Brain and Cognitive Science,Institute of Biophysics,The Chinese Academy of Sciences,Datun Road 15,Beijing 100101,China b Key Laboratory of Cell Proliferation and Differentiation of Ministry of Education,College of Life Sciences,Peking University,Beijing 100871,China c Department of Biological Science,Florida State University,Tallahassee,Florida 32304-4295,USA.  遺傳學(xué)報(bào). 2012(05)



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