發(fā)布時間：2021-06-17 22:12

　　背景及目的:傳統(tǒng)組織切片技術(shù)的一個明顯弊端在于切片間隔之間組織信息的丟失以及組織完整性的破壞。一種新興組織學技術(shù)-組織透明技術(shù)應(yīng)運而生,并迅速引起廣泛關(guān)注。組織透明技術(shù)是指使用一種試劑或幾種試劑組成的混合液,通過浸泡、電泳或灌注等處理方式,使大塊組織或完整器官達到視覺下或光學儀器下透明的組織學技術(shù)。相對于傳統(tǒng)的組織學技術(shù),組織透明技術(shù)具有在不破壞組織結(jié)構(gòu)的前提下觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢。尤其適用于具有“長距離傳導”特征的神經(jīng)系統(tǒng)的研究,可以配合神經(jīng)示蹤技術(shù)顯示完整的神經(jīng)傳導通路。雖然已經(jīng)有科研工作者使用組織透明技術(shù)與個別示蹤劑相結(jié)合的方式來研究某一具體的科學問題,但目前仍沒有文獻對不同示蹤劑與不同組織透明技術(shù)的兼容性進行系統(tǒng)闡述。方法:本研究第一部分首先選擇兩種不同類型的代表性示蹤劑,即熒光染料示蹤劑（Fluoro-Gold 和 Fluoro-Ruby）和攜帶熒光蛋白的病毒示蹤劑（rAAV9-hSyn-mCherry-WPRE-pA和rAAV9-hSyn-EGFP-WPRE-pA）,分別通過微量注射方式對動物的運動傳導束進行示蹤,切片后對比使用三種代表性透明方法FRUIT、3DISCO以及... 

【文章來源】：中國人民解放軍醫(yī)學院北京市

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【部分圖文】：

傳統(tǒng)的通過切片方式進行的組織學研究

越來越多的科研人員的關(guān)注。組織透明技術(shù)（Ｔｉｓｓｕｅｏｐｔｉｃａｌｃｌｅａｒｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）是指??使用一種試劑或幾種試劑組成的混合液，通過浸泡、電泳或灌注等處理方式，使大塊??組織或完整器官達到視覺下或光學儀器下透明的組織學技術(shù)［３］（圖２）。組織透明技??術(shù)的出現(xiàn)為實驗動物組織學研宄由二維升級到三維提供了強有力的研宄工具。雖然目??前組織透明技術(shù)尚未進入成熟應(yīng)用階段，仍有很多問題需要解決或改善，如熒光蛋白??的熒光保留尚不穩(wěn)定、有機透明溶劑處理不當具有潛在人體危害等等，但是在小型嚙??齒類動物的研宄上組織透明技術(shù)相對成熟，己經(jīng)有很多學者應(yīng)用此技術(shù)開展了具體的??科學研究??對研宄對象進行染色或熒光標記后，進行組織透明，可以呈現(xiàn)其完整三維形態(tài)。??傳統(tǒng)的研究方式即切片方式，雖然也可以通過較多的薄層切片重建三維影像，但切片??間的信息丟失無法避免，這種三維影像是一種“虛擬”的三維影像，相對于此，組織??透明技術(shù)可以“真實”地顯示研究對象的三維形態(tài)和空間比鄰，若有合適的光學顯微??成像設(shè)備支持

ＭＬ；?２．５?ＡＰ，?２．５ＭＬ；?－２．０?ＡＰ，?２．０?ＭＬ；?－１．５?ＡＰ，?２．５?ＭＬ；?－２．５?ＡＰ，?２．５?ＭＬ；?－２．５?ＡＰ，?１．５?ＭＬ；??－１．５?ＡＰ，?１．５?ＭＬ做十個標記［１７］，該標記點主要包括大鼠左側(cè)初級運動皮層區(qū)。使用微??型牙科鉆做骨窗至硬腦膜（圖１．１－Ａ）；參照《Ｔｈｅ?ＲＡＴＢｒａｉｎｉｎ?ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ?ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｓ》??定位，分組使用微量注射器按上述定位點向左側(cè)Ｍｌ區(qū)注射示蹤劑，使用納升微量控??制系統(tǒng)（圖１．１－Ｂ、Ｃ）控制進針深度為１．５＿，使注射位置位于富含錐體細胞的第５??層（運動性外導層），注射速度為６ｎｌ／ｓ，每點注射２００ｎｌ，留針５分鐘，緩慢撤針，??以防示蹤劑從針道溢出。ＦＧ組注射２％Ｆｌｕｏｒｏ－Ｇｏｌｄ溶液，ＦＲ組注射１０％Ｆｌｕｏｒｏ－Ｒｕｂｙ??溶液，Ｃｈｅｒｒｙ組注射同等劑量的ｒＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－ｍＣｈｅｒｒｙ－ＷＰＲＥ－ｐＡ?（病毒滴度：??７．３８Ｅ＋１２ｖｇ／ｍｌ）以及?ＧＦＰ?組注射總量如１?的?ｒＡＡＶ９－ｈＳｙｎ－ＥＧＦＰ－ＷＰＲＥ－ｐＡ?（病毒滴??度：３．８１Ｅ＋１２ｖｇ／ｍｌ）。注射完成后于普通飼養(yǎng)級別下飼養(yǎng)２周，正常進食水。２周后，??深度麻醉大鼠，麻醉方法同前，經(jīng)心灌注０．１ＭＰＢＳ８０ｍｌ，然后灌注含４％多聚甲醛的??ＰＢＳ溶液５０ｍｌ。取腦及脊髓

【參考文獻】：
期刊論文
[1]組織透明技術(shù)[J]. 王培新,張丹,尚愛加,侯冰.  神經(jīng)解剖學雜志. 2016(01)
[2]神經(jīng)系統(tǒng)細胞譜系和神經(jīng)束路示蹤技術(shù)[J]. 陶華平.  杭州師范大學學報(自然科學版). 2015(04)
[3]利用嗜神經(jīng)病毒跨突觸追蹤神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究進展[J]. 張志建,靳森,朱續(xù)濤,賈凡,王華東,劉青,何曉斌,徐富強.  生命科學. 2014(06)
[4]偽狂犬病毒跨突觸示蹤視覺系統(tǒng)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的研究進展[J]. 張翼,王雄偉,田春雷,羅然,陳中山.  現(xiàn)代生物醫(yī)學進展. 2013(22)



本文編號：3236015