目的:利用原核系統(tǒng)表達重組對人基質(zhì)金屬蛋白酶12（MMP-12）并純化,獲得高純度的人MMP-12蛋白。方法:在MMP-12氨基酸序列的N端加入His標簽和腸激酶位點序列,構(gòu)建MMP-12融合蛋白的原核表達載體,通過表達和親和純化獲得MMP-12融合蛋白,以腸激酶對融合蛋白進行酶切和二次純化,獲得高純度的人MMP-12。結(jié)果:構(gòu)建了pET-MMP-12表達載體,并在大腸桿菌中實現(xiàn)了穩(wěn)定高效表達。重組融合蛋白MMP-12經(jīng)親和層析純化后,相對分子質(zhì)量為42×10³,純度約95%。利用腸激酶對融合蛋白MMP-12進行酶切,酶切效率接近100%,通過二次純化獲得了MMP-12,相對分子質(zhì)量為40.8×10³,純度大于95%。結(jié)論:利用原核表達系統(tǒng)高效表達了MMP-12融合蛋白,通過親和純化和腸激酶酶切的方法可以獲得高純度的MMP-12,為后續(xù)抗體制備和配基篩選奠定了基礎(chǔ)。 

【文章來源】：生物技術(shù)通訊. 2020,31(01)

【文章頁數(shù)】：5 頁

【部分圖文】：

MMP-12表達菌株的表達篩選電泳分析

圖1 MMP-12表達菌株的表達篩選電泳分析超聲沉淀用1%的Triton X-100洗滌除去脂類物質(zhì)，然后用6 mol/L尿素+PBS充分溶解，上清以緩慢速度流經(jīng)鎳離子螯合的親和層析柱，再用PBS緩沖液緩慢平衡層析柱5個柱積，進行緩慢柱上復性。分別用150 mmol/L咪唑洗脫收集目的蛋白，150 mmol/L咪唑+6 mol/L尿素洗脫梯度未復性蛋白。12%SDS-PAGE結(jié)果顯示（圖3），經(jīng)過柱上復性后，MMP-12包涵體復性率將近50%，親和純化后，復性后的MMP-12融合蛋白純度在95%以上。

純化后MMP-12蛋白的HPLC純度測定圖

【參考文獻】：
期刊論文
[1]非小細胞肺癌組織中MMP-12的表達及臨床意義[J]. 潘虹,劉銘,張曉莉,張雪,黃君富,王玨,劉春江,帥維正,張可珺,府偉靈.  第三軍醫(yī)大學學報. 2010(02)



本文編號：3232595