本文關鍵詞：布魯氏菌OMP25影響巨噬細胞基因表達譜的初步研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：布魯氏菌(Brucella)引起的布魯氏菌病(以下簡稱布病)(Brucellosis)是一種世界性的人畜共患病,嚴重威脅著人類與動物的安全。外膜蛋白(outer membrane protein, OMP)是布魯氏菌的重要毒力因子之一,OMP25蛋白是布魯氏菌中一種主要的外膜蛋白,在布魯氏菌的致病過程中起著重要作用。構建B.melitensis M5-90-△OMP25株,為高效布魯氏菌疫苗的研制及布魯氏菌致病機制的闡釋提供理論依據。實驗根據羊種布魯氏菌(Brucella melitensis, B.melitensis) M5-90基因組序列和OMP25基因序列信息,設計OMP25基因的左(C)、右(N)同源臂的上、下游引物,以B.melitensis M5-90基因組為模板,應用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction, PCR)擴增C、N同源臂片段,純化回收目的片段。根據pEGFP-N1載體序列設計Kant基因上、下游引物,以pEGFP-N1質粒為模板擴增Kanr基因片段,并純化回收。將C同源臂片段、Kanr片段、N同源臂片段分別用Sac I+BamHⅠ、BamHⅠ+KpnⅠ、Kpn I+Apa I雙酶切,回收粘性末端,依次與相同酶切的自殺載體pGEM-7Zf(+)粘性末端進行連接轉化,成功構建pGEM-7Zf-△OMP25自殺質粒。將自殺質粒電轉化B.melitensis M5-90感受態(tài)細胞,用卡那霉素和氨芐霉素選擇培養(yǎng)基篩選雙同源重組B.melitensis M5-90-△OMP25株,鑒定遺傳穩(wěn)定性。結果成功構建遺傳穩(wěn)定的B.melitensis M5-90-△OMP25株。以B.melitensis M5-90株和B.melitensis M5-90-△OMP25株分別感染RAW264.7細胞4 h后,提取總RNA,分別進行Agilent基因表達譜芯片和LC Sciences microRNA Microarray-single基因表達譜芯片分析。對miRNAs芯片結果進行實時反轉錄聚合酶鏈式反應(real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, qRT-PCR)驗證,結果發(fā)現,mmu-miR-146a-5p和mmu-miR-155-5p表達上調,mmu-miR-149-3p和mmu-miR-5126表達下調。Agilent基因表達譜芯片結果表明,差異顯著的mRNAs有3897個,其中變化倍數2倍的mRNAs有2930個,變化倍數≥2倍的mRNAs有967個。miRNAs-mRNAs表達聯(lián)合分析結果表明,qRT-PCR驗證得到mmu-miR-149-3p與Bcl6b、Nos2、Ikbke、Slc31a2、Dusp16、Ifit1、Rhoc、Slc7a11、 Illrl1、Olr1有對應關系。
【關鍵詞】：B.melitensis M5-90-△OMP25株 mRNAs miRNAs qRT-PCR 聯(lián)合表達分析
【學位授予單位】：海南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：S852.614;R378.5
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-9
• 綜述一 布魯氏菌OMP25研究進展9-11
• 綜述二 基因敲除的原理、方法與應用11-23
• 1 基因敲除的原理11-12
• 2 基因敲除的方法12-21
• 2.1 敲除載體質粒的構建12-14
• 2.1.1 基因敲除載體的選擇12-13
• 2.1.2 靶基因與外源標記基因的選擇13-14
• 2.2 置換型質粒轉化受體細胞14-16
• 2.2.1 電擊穿孔轉化法14-15
• 2.2.2 Ca~(2+)處理熱激轉化法15
• 2.2.3 PEG(聚乙二醇)介導原生質體轉化法15
• 2.2.4 DNA顯微注射轉化法15-16
• 2.2.5 基因槍高速轉化法16
• 2.2.6 農桿菌介導轉化法16
• 2.3 外源基因轉化細胞后篩選16-21
• 2.3.1 同源重組類型17-19
• 2.3.2 基因分析法19-20
• 2.3.3 遺傳篩選法20-21
• 2.4 基因缺失后重組細胞的鑒定21
• 3 基因敲除的應用21-22
• 研究目的和意義22-23
• 第一部分 B.melitensis M5-90-△OMP25株的構建與檢測23-41
• 1 實驗材料23-26
• 1.1 菌株23
• 1.2 主要試劑23-24
• 1.3 儀器24
• 1.4 常用試劑配制24-26
• 2 實驗方法26-34
• 2.1 B.melitensis M5-90-△OMP25株構建流程圖26-27
• 2.2 B.melitensis M5-90-△OMP25株的構建27-34
• 2.2.1 B.melitensis M5-90株基因組獲取27
• 2.2.2 缺失株引物設計27
• 2.2.3 目的基因擴增27-28
• 2.2.4 回收純化PCR產物28-29
• 2.2.5 目的基因與pMD20-T載體連接29
• 2.2.6 連接產物轉化29
• 2.2.7 小量提取質粒DNA29-30
• 2.2.8 重組質粒的酶切鑒定30-31
• 2.2.9 同源重組自殺載體pGEM-7Zf-△OMP25的構建31
• 2.2.10 M5-90感受態(tài)細胞的制備31-32
• 2.2.11 電轉化M5-90感受態(tài)細胞32
• 2.2.12 B.melitensis M5-90-△OMP25株的篩選32
• 2.2.13 B.melitensis M5-90-△OMP25株的鑒定32-33
• 2.2.14 B.melitensis M5-90-△OMP25株的遺傳穩(wěn)定性檢測33
• 2.2.15 B.melitensis M5-90-△OMP25株凍存33-34
• 3 結果與分析34-40
• 3.1 OMP25左同源臂、右同源臂、Kan~r基因片段PCR的擴增結果34-35
• 3.2 重組質粒的酶切鑒定35-36
• 3.3 重組質粒pGEM-7Zf-AOMP25的酶切鑒定36-37
• 3.4 B.melitensis M5-90-△OMP25株鑒定37-39
• 3.5 B.melitensis M5-90-△OMP25株的遺傳穩(wěn)定性檢測39-40
• 4 討論40
• 5 結論40-41
• 第二部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7細胞的miRNAs表達譜分析41-52
• 1 實驗材料41-43
• 1.1 菌株及細胞41-42
• 1.2 主要試劑42
• 1.3 儀器42-43
• 1.4 常用試劑配制43
• 2 實驗方法43-47
• 2.1 芯片樣品制備43-47
• 2.1.1 RAW264.7細胞的培養(yǎng)43-44
• 2.1.2 凍存菌液復蘇44
• 2.1.3 菌體收集44
• 2.1.4 感染RAW264.7細胞44
• 2.1.5 總RNA提取44-45
• 2.1.6 總RNA變性瓊脂糖凝膠鑒定45
• 2.1.7 miRNA芯片實驗45
• 2.1.8 差異miRNA鑒定與分析45-47
• 3 結果與分析47-50
• 3.1 總RNA質檢結果47-48
• 3.2 差異miRNAs芯片結果48-49
• 3.3 qRT-PCR鑒定差異表達miRNAs49-50
• 4 討論50-51
• 5 結論51-52
• 第三部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7細胞的mRNAs表達譜分析52-64
• 1 實驗材料52-53
• 1.1 菌株及細胞52
• 1.2 主要試劑52-53
• 1.3 儀器53
• 1.4 常用試劑配制53
• 2 實驗方法53-55
• 2.1 芯片樣品制備53-55
• 2.1.1 RAW264.7細胞的培養(yǎng)53
• 2.1.2 凍存菌液復蘇53
• 2.1.3 菌體收集53
• 2.1.4 感染RAW264.7細胞53
• 2.1.5 總RNA提取53
• 2.1.6 總RNA質檢53
• 2.1.7 樣本標記和雜交53-54
• 2.1.8 芯片結果分析流程54-55
• 3 結果與分析55-63
• 3.1 總RNA質檢結果55-57
• 3.2 數據標準化結果57-60
• 3.3 GO富集結果60-62
• 3.4 差異mRNAs結果62-63
• 4 討論63
• 5 結論63-64
• 第四部分 感染B.melitensis M5-90-△OMP25株的RAW264.7的microRNAs表達譜和mRNAs表達譜的聯(lián)合分析64-75
• 1 實驗材料64
• 1.1 材料64
• 1.2 主要試劑64
• 1.3 儀器64
• 1.4 常用試劑配制64
• 2 實驗方法64-68
• 2.1 miRNAs-mRNAs表達聯(lián)合分析64-65
• 2.2 qRT-PCR驗證miRNAs-mRNAs表達聯(lián)合分析預測的靶基因65-68
• 2.2.1 RNA反轉錄65-66
• 2.2.2 qRT-PCR驗證66-68
• 3 結果與分析68-73
• 3.1 miRNAs-mRNAs表達聯(lián)合分析結果68-71
• 3.2 qRT-PCR驗證結果71-73
• 4 討論73-74
• 5 結論74-75
• 創(chuàng)新點75
• 全文結論75-76
• 參考文獻76-85
• 中英文縮寫詞對照表85-87
• 附錄87-94
• 致謝94

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中國期刊全文數據庫 前8條

1 吳杰;吳樹清;李東興;劉艷琴;張明月;海巖;;羊種布魯菌omp25的原核表達與免疫原性檢測[J];中國人獸共患病學報;2012年03期

2 邱業(yè)峰;徐杰;王玉飛;趙瑾;喬鳳;鐘志軍;汪舟佳;杜昕穎;曲R

本文編號：301100