本文關(guān)鍵詞：反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌八種藥物耐藥性的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：耐藥結(jié)核病尤其是耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant tuberculosis,MDR-TB,)及廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug resistant tuberculosis,XDR-TB,)的出現(xiàn)和流行成為了全球重點(diǎn)關(guān)注的公共衛(wèi)生問題及社會(huì)問題。長期以來,以細(xì)菌培養(yǎng)為基礎(chǔ)的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)被視為金標(biāo)準(zhǔn)廣泛應(yīng)用于臨床,但其耗時(shí)長,結(jié)核病患者在初期得不到及時(shí)有效的治療而延誤病情。新興的分子生物學(xué)方法在部分一線抗結(jié)核藥物中已經(jīng)取得了良好的檢測(cè)效果,幾乎可以與表型藥敏試驗(yàn)相媲美,但它們需要特殊的儀器試劑,且在二線藥物檢測(cè)中應(yīng)用較少。而反向斑點(diǎn)雜交(Reverse dot blot hybridization,RDBH)是一種基于基因擴(kuò)增上的分子雜交技術(shù),具有快速、簡便、高效、直觀等特點(diǎn)。本研究旨在建立一種能同時(shí)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)對(duì)四種一線和四種二線抗結(jié)核藥物耐藥性的RDBH技術(shù),以實(shí)現(xiàn)耐藥結(jié)核病的全面快速檢測(cè),為有效防治耐藥結(jié)核病提供新的技術(shù)手段。分別針對(duì)結(jié)核分枝桿菌八種藥物,包括四種一線抗結(jié)核藥抗結(jié)核藥異煙肼(Isoniazid,INH)、利福平(Rifampicin,RIF)、鏈霉素(Streptomycin,SM)、乙胺丁醇(Ethambutol,EMB)和四種二線抗結(jié)核藥氧氟沙星(Ofloxacin,OFX)、卡那霉素(Kanamycin,KAN)、阿米卡星(Amikacin,AMK)、卷曲霉素(Capreomycin,CPM),主要耐藥相關(guān)基因及常見的突變位點(diǎn),設(shè)計(jì)合成46條氨基標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針。通過小樣本試驗(yàn)優(yōu)化RDBH技術(shù)條件,建立RDBH技術(shù),并對(duì)326株和170株MTB臨床分離株分別進(jìn)行一線、二線抗結(jié)核藥物耐藥性檢測(cè),采用比例法藥敏試驗(yàn)和DNA測(cè)序結(jié)果作對(duì)照,初步評(píng)價(jià)該技術(shù)的檢測(cè)效能。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)條件的反復(fù)優(yōu)化,最終確定了探針序列、探針終濃度為0.5?M、雜交鹽離子濃度為5×SSPE/0.1%SDS、最適雜交溫度60℃、洗膜溫度50℃、POD-TMB為顯色體系。同時(shí)應(yīng)用比例法藥敏試驗(yàn)、DNA測(cè)序和RDBH技術(shù)分別對(duì)326株和170株MTB臨床分離株進(jìn)行了INH、RIF、SM、EMB四種一線抗結(jié)核藥物和OFX、KAN、AMK、CPM四種二線抗結(jié)核藥物的耐藥性檢測(cè),以比例法作參照,RDBH檢測(cè)INH、RIF、SM、EMB、OFX、KAN、AMK和CPM的敏感度分別為84.5%(185/219)、86.5%(166/192)、72.3%(120/166)、55.4%(51/92)、62.8%(59/94)、56.0%(14/25)、61.5%(8/13)和45.0%(9/20);特異度分別為95.3%(102/107)、95.5%(128/134)、91.3%(146/160)、82.1%(192/234)、100.0%(76/76)、100.0%(145/145)、98.7%(155/157)和99.3%(149/150);Kappa值分別為0.75、0.80、0.63、0.37、0.60、0.68、0.57和0.37;以DNA測(cè)序?yàn)闉閰⒄?八種藥物耐藥性檢出率分別為97.9%(189/193)、97.7%(171/175)、97.8%(134/137)、82.0%(91/111)和93.7%(59/63)、92.9%(13/14)、90.0%(9/10)、90.0%(9/10);特異度分別為99.2%(132/133)、97.4%(148/152)、100.0%(189/189)、99.1%(213/215)和100.0%(107/107)、99.4%(155/156)、99.4%(159/160)、99.4%(159/160);Kappa值分別為0.97、0.96、0.98、0.84、0.95、0.92、0.89和0.89。本研究建立的反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌八種藥物的耐藥性具有良好檢測(cè)效果,為開發(fā)快速檢測(cè)耐藥性試劑盒奠定基礎(chǔ),在結(jié)核病一、二線八種抗結(jié)核藥物耐藥性檢測(cè)和監(jiān)測(cè)上具有良好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)核分枝桿菌 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù) 耐藥性 耐藥相關(guān)基因
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R378.911
【目錄】：

• 摘要4-7
• ABSTRACT7-12
• 縮略詞12-14
• 第1章 緒論14-18
• 第2章 材料與方法18-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料18-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-34
• 第3章 結(jié)果34-66
• 3.1 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌耐藥性條件的建立與優(yōu)化34-40
• 3.2 一線抗結(jié)核藥物耐藥性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果40-55
• 3.3 二線抗結(jié)核藥物耐藥性試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果55-66
• 第4章 討論66-76
• 4.1 目前MTB藥物敏感性試驗(yàn)方法比較分析66
• 4.2 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測(cè)MTB耐藥性條件優(yōu)化66-67
• 4.3 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌一線藥物耐藥性67-71
• 4.4 反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌二線藥物耐藥性71-76
• 第5章 結(jié)論76-78
• 參考文獻(xiàn)78-84
• 文獻(xiàn)綜述84-96
• 參考文獻(xiàn)92-96
• 作者攻讀學(xué)位期間的科研成果96-97
• 資助本論文的科研項(xiàng)目97-98
• 致謝98

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