本文關(guān)鍵詞：新型肝片吸蟲多表位疫苗的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本課題組依據(jù)機(jī)體對(duì)肝片吸蟲的免疫保護(hù)機(jī)制和表位疫苗的構(gòu)建理論,合理選擇肝片吸蟲鞘脂激活樣蛋白2(Fh SAP-2)的Th和B細(xì)胞抗原表位,結(jié)合生物信息學(xué)軟件的分析,設(shè)計(jì)出一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的多表位疫苗CTB-SAPE、兩個(gè)單表位疫苗CTB-S1和CTB-S2。進(jìn)一步通過(guò)基因克隆、表達(dá)及蛋白純化等技術(shù),獲得該疫苗的重組蛋白,繼而利用免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定了多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特異性。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果簡(jiǎn)述如下:1、肝片吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白2(Fh SAP-2)的原核表達(dá)及分離純化生物信息學(xué)軟件Optimum TM Codon優(yōu)化密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)、最優(yōu)密碼子頻率(FOP)及GC含量以獲得適合大腸桿菌BL-21表達(dá)的Fh SAP-2基因序列,并克隆到原核表達(dá)載體p ET22b和p ET28a中,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)其表達(dá)并經(jīng)親和層析及離子交換色譜純化后獲得目的蛋白。結(jié)果 Optimum TM Codon獲得優(yōu)化后的Fh SAP-2序列,經(jīng)測(cè)序及酶切鑒定結(jié)果表明重組質(zhì)粒p ET22b-Fh SAP-2、p ET28a-Fh SAP-2構(gòu)建成功,進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Fh SAP-2在p ET28a中包涵體部位表達(dá),可溶部位不表達(dá);在p ET22b中可溶部位表達(dá)量低,包涵體部位無(wú)表達(dá)。繼而經(jīng)Ni-NTA柱親和純化及離子交換色譜純化獲得電泳純的Fh SAP-2蛋白。2、多表位疫苗CTB-SAPE的設(shè)計(jì)及重組表達(dá)載體的構(gòu)建本課題組在前期文獻(xiàn)調(diào)研基礎(chǔ)上合理選擇Fh SAP-2優(yōu)勢(shì)B和Th細(xì)胞抗原表位,通過(guò)表位疫苗的構(gòu)建理論和生物信息學(xué)分析,對(duì)Fh SAP-2抗原表位的連接順序、間隔序列(Linker)和表位拷貝數(shù),加以分析和確定,為了更好地激活粘膜免疫,在疫苗的設(shè)計(jì)中引入了分子內(nèi)佐劑CTB,最終設(shè)計(jì)出具有科學(xué)合理結(jié)構(gòu)的肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE,并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)兩個(gè)單表位疫苗CTB-S1和CTB-S2。利用酶切和PCR技術(shù)構(gòu)建了重組表達(dá)載體p ETCTB-SAPE、p ETCTB-S1和p ETCTB-S2,并將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)大腸桿菌中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:重組表達(dá)載體p ETCTB-SAPE、p ETCTB-S1和p ETCTB-S2與設(shè)計(jì)序列完全一致。3、新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的表達(dá)與純化本研究誘導(dǎo)表達(dá)各個(gè)肝片吸蟲表位疫苗抗原蛋白CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2并經(jīng)Ni-NTA親和層析純化目的蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2均可獲得高效表達(dá),并且主要以包涵體形式表達(dá);經(jīng)Ni-NTA親和層析純化后得到電泳純的CTB-SAPE、CTB-S1和CTB-S2,為肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的免疫原性和免疫特異性研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。4、新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE免疫原性和免疫特異性的研究本研究通過(guò)分子生物學(xué)和免疫學(xué)等方法來(lái)鑒定肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE中各個(gè)抗原表位是否保持有其免疫原性和免疫特異性、分子內(nèi)黏膜佐劑CTB組分與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1的結(jié)合活性、肝片吸蟲多表位肽疫苗CTB-SAPE的免疫原性是否優(yōu)越于肝片吸蟲單表位疫苗(CTB-S1和CTB-S2)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE具有良好的免疫原性和免疫特異性,能夠激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞免疫應(yīng)答和高滴度表位特異性抗體。新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE不同于以往所研制的肝片吸蟲疫苗,激發(fā)的免疫應(yīng)答具有更高的免疫針對(duì)性和免疫特異性。
【關(guān)鍵詞】：肝片吸蟲 鞘脂激活蛋白樣蛋白 2 表位疫苗
【學(xué)位授予單位】：青海大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-13
• 主要符號(hào)對(duì)照表13-14
• 第1章 引言14-17
• 第2章 肝片吸蟲鞘脂激活蛋白樣蛋白 2(Fh SAP-2)的原核表達(dá)及分離純化17-27
• 2.1.實(shí)驗(yàn)材料17-19
• 2.1.1 質(zhì)粒和菌株17
• 2.1.2 主要試劑17-19
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器19
• 2.2.實(shí)驗(yàn)方法19-21
• 2.2.1 Fh SAP-2 序列的獲得及優(yōu)化19-20
• 2.2.2 Fh SAP-2 基因的克隆及鑒定20
• 2.2.3 Fh SAP-2 蛋白的表達(dá)及純化20
• 2.2.4 肝片吸蟲總蛋白提取20-21
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-25
• 2.3.1 Fh SAP-2 序列原核表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化21-22
• 2.3.2 重組質(zhì)粒p ET22b-SAP-2 及p ET28a-SAP-2 的鑒定22-23
• 2.3.3 p ET22b-SAP-2 及p ET28a SAP-2 蛋白表達(dá)部位鑒定23-24
• 2.3.4 純化后Fh SAP-2 的SDS-PAGE考察24-25
• 2.4 討論25-26
• 2.5 結(jié)論26-27
• 第3章 新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的設(shè)計(jì)及重組表達(dá)載體的構(gòu)建27-45
• 3.1.實(shí)驗(yàn)材料27-30
• 3.1.1 Fh SAP-2 氨基酸序列27
• 3.1.2 霍亂毒素B亞基（CTB）27-28
• 3.1.3 質(zhì)粒和菌株28
• 3.1.4 主要試劑28-29
• 3.1.5 主要溶液及配方29
• 3.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器29-30
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法30-35
• 3.2.1 肝片吸蟲優(yōu)勢(shì)抗原表位的選擇30
• 3.2.2 抗原表位連接順序、重復(fù)次數(shù)、間隔序列的設(shè)計(jì)30
• 3.2.3 多表位肽SAPE與霍亂毒素B亞基的偶聯(lián)設(shè)計(jì)30-31
• 3.2.4 新型肝片吸蟲多表位肽融合蛋白CTB-SAPE的三級(jí)結(jié)構(gòu)分子建模31
• 3.2.5 重組表達(dá)載體p ETCTB-SAPE的構(gòu)建31-33
• 3.2.6 重組表達(dá)載體p ETCTB-S1、p ETCTB-S2的構(gòu)建33-35
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-43
• 3.3.1 Fh SAP-2 優(yōu)勢(shì)抗原表位的選擇35
• 3.3.2 新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的設(shè)計(jì)方案35-37
• 3.3.3 肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE間隔序列設(shè)計(jì)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的分子建模37-38
• 3.3.4 重組載體p ETCTB-SAPE的構(gòu)建38-40
• 3.3.5 重組表達(dá)載體p ETCTB-S1、p ETCTB-S2的構(gòu)建40-43
• 3.4 討論43-44
• 3.5 結(jié)論44-45
• 第4章 新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE的表達(dá)與純化45-53
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料45-47
• 4.1.1 主要試劑45-46
• 4.1.2 主要溶液及配方46
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器46-47
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法47-49
• 4.2.1 基因工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定47-48
• 4.2.2 Ni-NTA鎳離子親和層析柱的純化48-49
• 4.2.3 重組蛋白的透析復(fù)性和濃縮49
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果49-51
• 4.3.1 基因工程菌株的誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定49-50
• 4.3.2 鞘脂激活蛋白多表位融合蛋白CTB-SAPE的純化及單表位融合蛋白CTB-S1、CTB-S2的純化50-51
• 4.4 討論51-52
• 4.5 結(jié)論52-53
• 第5章 新型肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE免疫原性和免疫特異性的研究53-68
• 5.1 實(shí)驗(yàn)材料53-55
• 5.1.1 電泳純肝片吸蟲表位肽融合蛋白53
• 5.1.2 高純度Fh SAP-2 表位肽蛋白53-54
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物54
• 5.1.4 主要試劑54-55
• 5.1.5 主要溶液及配方55
• 5.1.6 實(shí)驗(yàn)儀器55
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法55-57
• 5.2.1 BALB/c小鼠的免疫接種55-56
• 5.2.2 GM1-ELISA56
• 5.2.3 特異性抗體的ELISA檢測(cè)56-57
• 5.2.4 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)57
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果57-65
• 5.3.1 Fh SAP-2 表位（Fh SAP22130）特異性抗體的檢測(cè)57-58
• 5.3.2 Fh SAP-2 表位（Fh SAP27685）特異性抗體的檢測(cè)58-59
• 5.3.3 Fh SAP-2 表位肽融合蛋白與GM1結(jié)合活性的檢測(cè)59-60
• 5.3.4 肝片吸蟲多表位疫苗CTB-SAPE免疫組小鼠脾臟淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的檢測(cè)60-63
• 5.3.5 肝片吸蟲多表位疫苗Ig G1、Ig G2a和Ig A特異性抗體的檢測(cè)63-64
• 5.3.6 肝片吸蟲總蛋白和Fh SAP-2 特異性Ig G抗體檢測(cè)64-65
• 5.4 討論65-66
• 5.5 結(jié)論66-68
• 全文總結(jié)68-70
• 綜述70-78
• 參考文獻(xiàn)78-86
• 致謝86-88
• 作者簡(jiǎn)歷88-87

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本文編號(hào)：292603