研究背景:血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是一種調(diào)節(jié)巨核細(xì)胞生長的特異性細(xì)胞因子,研究發(fā)現(xiàn)其不僅在造血系統(tǒng)有重要作用,在造血系統(tǒng)外也有作用,例如TPO可以作用于內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞和卵巢等組織。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),血小板生成素具有潛在的細(xì)胞保護(hù)作用,TP0對于藥物和缺血引起的心肌損傷具有保護(hù)作用;TP0對于新生大鼠缺血缺氧性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用。所以,我們提出TPO對于內(nèi)皮細(xì)胞也具有保護(hù)作用,并探索其相關(guān)作用機(jī)制。相關(guān)研究己經(jīng)證實TPO與其受體(c-Mpl)結(jié)合后可以作用于相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來影響細(xì)胞的成熟、增殖以及凋亡。故我們推測TPO通過其受體作用于相關(guān)信號通路發(fā)揮保護(hù)作用。因此本實驗主要研究TPO對于缺血缺氧引起的內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞損傷是否具有保護(hù)作用,并進(jìn)一步探索保護(hù)作用的機(jī)制。研究方法:一、TPO對CoCl2作用下內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響l.CCK-8法探索TPO保護(hù)缺氧損傷的內(nèi)皮細(xì)胞的最佳作用條件;2.流式細(xì)胞術(shù)檢測TPO對缺氧所致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率、凋亡蛋白酶Caspase-3的表達(dá)以及線粒體膜電位的變化。二、TPO抑制CoCl2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制1.采用Q-PCR,Western Blot方法檢測內(nèi)皮細(xì)胞上TPO受體(c-Mpl)mRNA或蛋白的表達(dá);2.使用Western Blot的方法檢測TPO對PI3K/AKT通路磷酸化水平的影響。研究結(jié)果:一、TPO對CoCl2作用下內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響1.CCK-8結(jié)果示:使用不同濃度的CoCl2處理HUVEC細(xì)胞24h后,細(xì)胞存活率逐漸下降;選用低于IC50值的CoCl2濃度800μmol/L處理HUVEC細(xì)胞作為細(xì)胞缺氧模型。在CoCl2處理HUVEC細(xì)胞前,使用不同濃度的TPO預(yù)處理48h,細(xì)胞活性得到明顯改善,TPO濃度為100μg/L時細(xì)胞活性為(72.10 ±5.11)%,比CoCl2組明顯升高(45.39±9.22)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P= 0.025),選用此濃度建立細(xì)胞保護(hù)模型。2.檢測內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示:與Control組相比較(6.33 ± 0.80)%,CoCl2組的凋亡率明顯升高(19.54±1.40)%,P0.001;而TPO+CoCl2組的細(xì)胞凋亡率較前者明顯下降(12.19 ±0.84)%,P0.001;這提示TPO對HUVEC損傷有保護(hù)作用。3.各組細(xì)胞凋亡蛋白酶Caspase-3的表達(dá)結(jié)果顯示:CoCl2組表達(dá)凋亡蛋白酶Caspase-3 的細(xì)胞比例為(43.62±1.83)%,顯著高于Control組(6.80±0.30)%,P0.001;而TPO能顯著降低由CoCl2導(dǎo)致的Caspase-3表達(dá)升高(28.83 ±3.00)%,P = 0.039。4.線粒體膜電位變化的結(jié)果顯示:CoCl2組細(xì)胞線粒體膜電位明顯低于Control 組,(41.09±4.52)%VS(5.91 ±0.54)%,P0.001;而 TPO 組 HUVEC細(xì)胞的線粒體膜電位較CoCl2組升高,(14.52 ±2.47)%,P= 0.038。二、TPO抑制CoCl2誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制1.采用Q-PCR,Western Blot方法都可以檢測到內(nèi)皮細(xì)胞TPO受體mRNA或蛋白的表達(dá);2.TPO還可以刺激內(nèi)皮細(xì)胞PI3K/AKT通路的活化,對細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用研究結(jié)論:1.TPO對化學(xué)性缺氧所致的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡起保護(hù)作用;2.其機(jī)制可能是通過活化PI3K/AKT通路,從而減少細(xì)胞凋亡蛋白酶Caspase-3的活化表達(dá)和穩(wěn)定線粒體膜電位來發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

圖１邋ＴＰＯ發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的信號通路圖［５７］逡逑Ｆｉｇ邋１邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋ＴＰＯ［５１逡逑，ＴＰＯ還參與機(jī)體創(chuàng)傷后的應(yīng)激修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等多種作用。ＰＯ能被多種腫瘤細(xì)胞分泌并成為凋亡抑制因子，可能因此促

使得細(xì)胞的存活率逐漸下降（ｒ＝－０．９９７），當(dāng)８００邋ｐｍｏｌ／Ｌ的ＣｏＣｌ２作用２４ｈ時，細(xì)逡逑胞的抑制率可達(dá)５０％以上，為理想的造模條件。綜合考慮選用８００邋ｐｍｏｌ／Ｌ的逡逑ＣｏＣｌ２作用２４邋ｈ作為最佳造模條件（圖２）。逡逑１２０－．逡逑１００－逡逑＾邋８0逡逑＝６０－逡逑｜邐４。－逡逑＝邋２０－邋？逡逑０＞逡逑Ｏ邋0Ｈ邐１邐１邐１邐１邐１邐１逡逑０邐０邐２００邐４００邐６００邐８００邐１０００逡逑ＣｏＣＩ２邋濃度｛ｊｍｏｌ／Ｌ｝逡逑圖２不同濃度的ＣｏＣｌ２對ＨＵＶＥＣ細(xì)胞的影響，當(dāng)ＣｏＣｌ２的濃度為８００邋ｐｍｏｌ／Ｌ細(xì)胞的抑制逡逑率達(dá)５０％以上（ｎ邋＝邋３，ｒ＝－０．９９７）。逡逑Ｆｉｇ邋２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋ｏｆ邋Ｃ０ＣＩ２邋ｏｎ邋ＨＵＶＥＣ邋ｃｅｌｌｓ．邋Ｔｈｅ邋ａｓｓａｙ邋ｉｎｄｉｃａｔｅｓ邋ｔｈａｔ逡逑ｔｈｅ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｒａｔｅ邋ｗａｓ邋ｍｏｒｅ邋ｔｈａｎ邋５０％邋ｗｈｅｎ邋Ｃ０ＣＩ２邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ邋ｉｓ邋８００邋｜ｉｍｏｌ／Ｌ（邋ｎ邋＝邋３，逡逑ｒ＝－０．９９７）．逡逑３．２ＴＰＯ對ＨＵＶＥＣ細(xì)胞凋亡的影響逡逑ＣＣＫ－８法探索ＴＰＯ保護(hù)缺氧所致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的最佳條件，應(yīng)用不同濃度逡逑的邋ＴＰＯ邋（１０、５０、１００、２００、５００邋ｐｇ／Ｌ）預(yù)處理邋ＨＵＶＥＣ邋細(xì)胞邋４８ｈ邋后，ＴＰＯ邋１０－５０逡逑ｐｇ／Ｌ的濃度范圍內(nèi)，呈濃度依賴性的對抗ＣｏＣｌ２誘導(dǎo)的細(xì)胞活性降低作用，隨逡逑著ＴＰＯ的濃度升高到一定程度

積細(xì)胞數(shù)量不如正常組致密，細(xì)胞間隙變大，細(xì)胞數(shù)目減少，凋亡細(xì)胞明顯增逡逑多；ＴＰＯ保護(hù)組的細(xì)胞皺縮變圓，細(xì)胞間隙變大，但細(xì)胞之間仍然存在聯(lián)系，逡逑凋亡細(xì)胞相對較少（圖４）。逡逑１５逡逑

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前8條

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本文編號：2827173