發(fā)布時(shí)間：2017-03-31 18:06

  本文關(guān)鍵詞：沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的研制與初步應(yīng)用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：沙門菌種類繁多,已知的血清型已有2600多種,嚴(yán)重影響人類健康和畜牧業(yè)的發(fā)展,對(duì)沙門菌的檢測(cè)和診斷是防控沙門菌病的重要手段之一。沙門菌致病島2(Salmonella pathogenicity island 2, SPI-2)的基因編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)促進(jìn)沙門菌病。沙門菌在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制發(fā)生在沙門菌膜性小泡(SCV)中,并且通過毒力島2 T3SS轉(zhuǎn)移大約30個(gè)效應(yīng)蛋白到宿主膜性系統(tǒng)及細(xì)胞質(zhì)中。由沙門菌毒力島2編碼的效應(yīng)蛋白SpiC對(duì)于沙門菌在宿主吞噬性細(xì)胞內(nèi)的存活起重要作用,它是在沙門菌中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)宿主轉(zhuǎn)運(yùn)干擾蛋白,能被SPI-2 T3SS導(dǎo)出細(xì)菌并進(jìn)入宿主細(xì)胞胞質(zhì)中,并與宿主細(xì)胞的蛋白互作,抑制吞噬體和溶酶體的融合。spiC基因在NCBI序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn),是在沙門菌中特有的,并且同源性在99%-100%。單克隆抗體技術(shù)作為現(xiàn)代生命科學(xué)研究的重要工具,在基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究方面以及免疫學(xué)診斷方面有著不可或缺的作用。因此,篩選具備沙門菌特異性阻斷效果的單克隆抗體,研發(fā)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)試劑(盒),為沙門菌的檢測(cè)和沙門菌病的診斷提供快速、有效的技術(shù)手段勢(shì)在必行。本研究以純化的重組融合蛋白rHis-SpiC為免疫原,免疫6-8周齡的BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0融合,以純化的重組融合蛋白rGST-SpiC為檢測(cè)原,經(jīng)過間接ELISA檢測(cè)和多次亞克隆,共獲得7株能穩(wěn)定分泌SpiC蛋白特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為3G9、3B2、4D9、4F7、5F8、6H2、6B9。對(duì)所制備的7株單克隆抗體進(jìn)行亞類測(cè)定,結(jié)果顯示7株SpiC單克隆抗體其中5株為IgG1,2株為IgG2a;對(duì)7株單克隆抗體進(jìn)行腹水效價(jià)測(cè)定,結(jié)果它們的腹水ELISA效價(jià)均很高,在1×105-1×107之間：?jiǎn)慰寺】贵w的特異性鑒定結(jié)果顯示7株單抗均與SpiC蛋白發(fā)生反應(yīng),而與其他蛋白不發(fā)生反應(yīng)。Western blotting鑒定結(jié)果顯示,7株SpiC單克隆抗體均可與rGST-SpiC和rHis-SpiC發(fā)生特異性反應(yīng),出現(xiàn)目的條帶大小一致的特異性條帶,而與重組菌BL21 (pGEX-6p-1)和BL21 (DE3)(pET)無特異性反應(yīng)。將沙門菌點(diǎn)在硝酸纖維素膜(NC膜)上,利用單抗的特異性建立Dot-ELISA方法,以檢測(cè)沙門菌,結(jié)果顯示,單抗僅能與沙門菌發(fā)生特異性反應(yīng),而不和非沙門菌發(fā)生特異性反應(yīng)。用該方法共檢測(cè)189株菌株,其中陽(yáng)性為173株,陰性為16株,與stn檢測(cè)結(jié)果一致。以純化后的融合蛋白GST-SpiC作為包被抗原,并根據(jù)7株單抗的特性和腹水效價(jià),挑選出單抗5F8作為競(jìng)爭(zhēng)抗體建立了檢測(cè)SpiC蛋白抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。經(jīng)過蛋白包被濃度、抗體稀釋濃度、血清稀釋度、最適封閉液、競(jìng)爭(zhēng)時(shí)間等條件的優(yōu)化,最終建立了靈敏度高、特異性好的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法,并利用該方法對(duì)感染沙門菌的雞血清進(jìn)行檢測(cè)。用該方法檢測(cè)了雞血清149份,結(jié)果顯示,共檢出121份陽(yáng)性樣品,檢出率為81.21%,陰性樣品28份,檢出率為18.79%。玻板凝集試驗(yàn)共檢出陽(yáng)性樣品數(shù)為70,陽(yáng)性檢出率為46.98%,陰性樣品79,檢出率為53.02%,本研究建立的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法具有簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高等特點(diǎn),可以被廣泛用于雞血清中沙門菌抗體水平的檢測(cè)。綜上所述,本研究共成功制備了7株能穩(wěn)定分泌沙門菌SpiC蛋白特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株,7株單抗均可特異性識(shí)別原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的SpiC蛋白,具有較好的特異性和免疫反應(yīng)性,為SpiC的相關(guān)基礎(chǔ)研究提供了重要試劑,同時(shí)在沙門菌檢測(cè)和沙門菌病的診斷研究以及各種新型疫苗和診斷試劑的研發(fā)方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。
【關(guān)鍵詞】：沙門菌 SpiC蛋白 單克隆抗體 競(jìng)爭(zhēng)ELISA
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.4;R392
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• Abstract4-8
• 符號(hào)說明8-10
• 文獻(xiàn)綜述10-21
• 1 沙門菌的特點(diǎn)和危害10-11
• 2 沙門菌檢測(cè)方法11-15
• 3 SpiC蛋白研究進(jìn)展15-16
• 參考文獻(xiàn)16-21
• 第一章 沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的研制和鑒定21-34
• 1 材料21-22
• 2 方法22-27
• 2.1 抗原SpiC蛋白的制備22-23
• 2.2 單克隆抗體的制備23-26
• 2.3 SpiC單克隆抗體的鑒定26-27
• 3 結(jié)果27-31
• 3.1 免疫原制備27
• 3.2 檢測(cè)原制備27
• 3.3 雜交瘤細(xì)胞株的建立27-28
• 3.4 單抗亞類以及腹水效價(jià)鑒定結(jié)果28-29
• 3.5 腹水的純化29-30
• 3.6 單抗與重組蛋白的特異性鑒定30
• 3.7 Western blotting分析30-31
• 4 討論31-32
• 參考文獻(xiàn)32-34
• 第二章 沙門菌SpiC蛋白單克隆抗體的初步應(yīng)用34-48
• 1 材料34
• 2 方法34-37
• 2.1 單抗與沙門菌的特異性反應(yīng)34-35
• 2.2 Dot-ELISA檢測(cè)沙門菌35
• 2.3 檢測(cè)沙門菌抗體的單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法35-37
• 3 結(jié)果37-43
• 3.1 單抗Dot-ELISA的特異性37
• 3.2 Dot-ELISA檢測(cè)沙門菌結(jié)果37-38
• 3.3 檢測(cè)沙門菌抗體的單抗競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法38-43
• 4 討論43-46
• 參考文獻(xiàn)46-48
• 全文小結(jié)48-49
• 致謝49-50
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文50-51

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