【摘要】：Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）是天然免疫中最重要的模式識別受體之一，它能夠識別并結(jié)合一系列具有相同病原相關(guān)分子模式（PAMPs）的病原體和內(nèi)源性的損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），向細胞內(nèi)傳遞信號，啟動機體的免疫應(yīng)答并激活炎癥反應(yīng)。Toll樣受體的識別范圍廣泛，既包括細菌、病毒和寄生蟲等病原體，還包含腫瘤抗原以及自身衰老和壞死細胞釋放的分子。Toll樣受體不僅表達于免疫細胞，也表達于腫瘤細胞。因此，Toll樣受體與宿主的感染、炎癥反應(yīng)和腫瘤發(fā)生等多種疾病存在交互關(guān)聯(lián)。但是截至目前為止，Toll樣受體在腫瘤細胞中的作用機制仍然不是很清楚。 感染和腫瘤發(fā)生過程中常伴隨著Toll樣受體信號激活的細胞吞噬和自噬現(xiàn)象。目前，在嚴重感染和腫瘤的治療領(lǐng)域中，針對Toll樣受體的靶向治療引起了越來越多的關(guān)注。但是Toll樣受體信號誘導(dǎo)細胞自噬和病原體吞噬的分子機制仍然不清楚，介導(dǎo)Toll樣受體信號通路的細胞自噬相關(guān)因子以及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍亟待深入探討。MAP1S是近年來新發(fā)現(xiàn)的自噬相關(guān)因子，在各種組織中廣泛表達，并且對細胞自噬的發(fā)生和發(fā)展具有促進作用。截至目前，關(guān)于MAP1S介導(dǎo)Toll樣受體信號通路調(diào)控及其機制的研究仍未見報道。本研究以MAP1S為研究對象，從Toll樣受體信號促進巨噬細胞的吞噬功能和Toll樣受體信號通過介導(dǎo)自噬抑制乳腺癌細胞的增殖與遷移兩個層面，分析了Toll樣受體信號促進細胞吞噬和自噬的分子機制，并探討了MAP1S在Toll樣受體信號串聯(lián)細胞吞噬和自噬功能中的作用。 細胞吞噬和自噬的過程中Toll樣受體處于激活狀態(tài)，并引發(fā)炎癥反應(yīng)，提示三者之間存在著必然的聯(lián)系。本研究以MAP1S基因敲除鼠為研究模型，利用不同的Toll樣受體激活劑刺激小鼠原代巨噬細胞，比較了野生型和MAP1S缺失的巨噬細胞分泌細胞因子的差異，發(fā)現(xiàn)MAP1S的缺失顯著地下調(diào)了TLR2配體LTA誘導(dǎo)巨噬細胞分泌IL-6的含量。在檢測TLR2信號調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄激活因子活性實驗中，發(fā)現(xiàn)MAP1S的缺失抑制了TLR2信號激活的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活因子p38的活性。在野生型巨噬細胞中，MAP1S的表達響應(yīng)TLR2信號而顯著性上調(diào)，并且表現(xiàn)出對LTA誘導(dǎo)的時間依賴性。此外，表達上調(diào)的MAP1S通過激活細胞自噬，反饋抑制Toll樣受體信號持續(xù)活化所致的炎癥反應(yīng)。以上結(jié)果提示，MAP1S對巨噬細胞TLR2信號具有雙向調(diào)控作用，具體地說，MAP1S參與早期TLR2信號誘導(dǎo)細胞因子的表達，而反饋性抑制晚期TLR2信號持續(xù)激活所致的過強炎癥反應(yīng)。研究中進一步發(fā)現(xiàn)，MAP1S的缺失降低了巨噬細胞部分TLRs的基礎(chǔ)表達，從而影響了巨噬細胞的細菌吞噬功能，而且巨噬細胞的細菌殺傷能力同樣由于MAP1S的缺失而顯著下調(diào)。 在腫瘤細胞的Toll樣受體信號與細胞自噬發(fā)生的關(guān)系研究中，鑒于前期研究結(jié)果提示，TLR5配體flagellin對乳腺癌細胞的增殖具有顯著的抑制作用，因此，我們首先利用全細胞MALDI-TOF質(zhì)譜確認了flagellin對乳腺癌細胞MCF-7活性的抑制作用，并證實了自噬相關(guān)因子MAP1S在多種乳腺癌細胞中的普遍表達。MTT細胞增殖實驗和軟瓊脂單細胞克隆形成實驗的結(jié)果表明，MAP1S沉默的MCF-7細胞不響應(yīng)flagellin的抑制作用。經(jīng)flagellin處理的MCF-7細胞發(fā)生G1期阻滯現(xiàn)象，細胞周期蛋白cyclinD1的表達顯著下調(diào)，而周期依賴型激酶抑制因子p27的表達明顯上調(diào)，但MAP1S沉默的MCF-7細胞的細胞周期沒有發(fā)生任何改變。由此證實，MAP1S可通過TLR信號通路調(diào)控乳腺癌細胞的增殖，當TLR受到特異性配體激活后，可通過MAP1S介導(dǎo)細胞增殖的調(diào)控信號通路。 考慮到MAP1S具有調(diào)控細胞骨架網(wǎng)絡(luò)動態(tài)穩(wěn)定的功能，本研究采用侵襲小室和細胞劃痕修復(fù)實驗，檢測了MAP1S是否影響經(jīng)flagellin處理的MCF-7細胞的侵襲和遷移能力。實驗結(jié)果表明，flagellin能夠極大程度地抑制MCF-7細胞的侵襲和遷移，但在MAP1S沉默的MCF-7細胞中，flagellin的抑癌作用受到了限制，提示MAP1S在flagellin抑制腫瘤細胞增殖和遷移的過程中起著關(guān)鍵作用。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，MAP1S在flagellin誘導(dǎo)MCF-7細胞表達細胞因子IL-8和TNF-α的過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。MAP1S也會響應(yīng)TLR5信號而表達上調(diào)，表達上調(diào)的MAP1S通過誘導(dǎo)細胞發(fā)生自噬反應(yīng)，反饋性地抑制腫瘤細胞中TLR5信號持續(xù)激活的炎癥反應(yīng)。 為了探討MAP1S在巨噬細胞Toll樣受體信號促進細胞吞噬和在乳腺癌細胞Toll樣受體信號抑制腫瘤細胞增殖和遷移過程中的分子機制，本研究利用免疫印跡和免疫熒光實驗，分別對巨噬細胞、MCF-7細胞和正常的人胚腎HEK293T細胞中Toll樣受體信號誘導(dǎo)自噬標志分子LC3的LC3II/I蛋白比例以及LC3聚集體形成（自噬或吞噬功能增加的標志）進行了分析。結(jié)果表明，只有MAP1S表達響應(yīng)的Toll樣受體信號才能誘導(dǎo)細胞中的LC3聚集體的形成和LC3II/I比例的增加，提示在MCF-7細胞中flagellin/TLR5信號誘導(dǎo)了腫瘤細胞的自噬發(fā)生，在巨噬細胞中LTA或細菌/TLR2信號促進了細胞的吞噬功能。 為獲得MAP1S介導(dǎo)TLR信號通路活化的調(diào)控位點，本研究進一步分析了MAP1S與Toll樣受體接頭蛋白MyD88的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)MAP1S與MyD88具有相互作用，并且MAP1S可以通過響應(yīng)Toll樣受體信號將MyD88轉(zhuǎn)運至LC3II結(jié)合的自噬體或吞噬體，促進自噬體/吞噬體的成熟。而響應(yīng)性上調(diào)表達的MAP1S可以通過誘導(dǎo)細胞自噬的發(fā)生，選擇性地降解MyD88，反饋抑制Toll樣受體信號的持續(xù)活化。 綜上所述，本文通過研究自噬相關(guān)因子MAP1S對巨噬細胞和腫瘤細胞Toll樣受體信號的調(diào)控，證實了MAP1S通過介導(dǎo)Toll樣受體信號促進細胞吞噬和自噬的功能，這一發(fā)現(xiàn)是Toll樣受體、細胞自噬與吞噬作用相關(guān)性的最新證據(jù)，也為研究Toll樣受體信號促進細胞自噬和吞噬作用的深層機制提供了一條新的線索。
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R392.12
【圖文】：

圖 1-1 細胞吞噬過程[92]Fig. 1-1 Phases of phagocytosis噬細胞的受體細胞的受體通過結(jié)合被吞噬粒子表面的配體啟動吞噬的最初gulfment）。很多受體參與吞噬過程，F(xiàn)cγ受體（FcγRs）在吞噬比較清晰，F(xiàn)cγ受體通過自身磷酸化或由Src家族蛋白激酶磷酸胞內(nèi)信號[7]。脂筏（lipid raft）起著偶聯(lián)蛋白激酶和受體的作用相關(guān)的細胞吞噬中并不起主要作用[94]�？乖岢始毎饕耐虊蜃R別假絲酵母細胞表面表達的β-葡聚糖，但是假絲酵母的致體能夠轉(zhuǎn)換為絲狀形態(tài)逃避Dectin-1的識別和吞噬細胞的吞噬[9受體如scavenger receptors (SR)在細胞吞噬中的作用尚不明確，SR敲除鼠來源的樹突狀細胞對大腸桿菌的內(nèi)吞能力有所下降[97細胞對細菌的吞噬常伴隨著由 TLR 信號激活的炎癥反應(yīng)，這一噬和 TLR 有著功能上的相互聯(lián)系。Blander 和 Medzhitov[5, 6]發(fā)

膜直至形成完整的自噬體（autophagosome）。自噬體和溶酶體（lysosome）合，發(fā)展成熟成為自噬溶酶體（autolysosome），內(nèi)涵物在自噬溶酶體中降解圖 1-2）。已有研究證明，自噬體形成初期的膜來源于線粒體、高爾基復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)[121, 122]，但是自噬泡的膜延長過程中的膜來源及機制尚不清晰。介導(dǎo)膜泡運和融合作用的 SNAREs 或小 GTPase在自噬體形成過程中沒有直接發(fā)揮作用。管定位于高爾基的 GTPase Rab33B 與 Atg16L 有直接相互作用，但是其相互用在自噬中的作用仍不清晰[123]。近期研究表明，Atg9 的自身多聚化能促進的融合。Atg9 是唯一被發(fā)現(xiàn)與自噬體形成有關(guān)的完整的膜蛋白。在酵母中，tg9 定位于自噬泡組裝位點（PAS）及其周圍結(jié)構(gòu)[124]。Atg11，Atg23 和 Atg27于 Atg9 轉(zhuǎn)運到 PAS 的過程至關(guān)重要[125-128]。因此，Atg9 可能作為運載膜的體通過動態(tài)的自身相互作用在自噬泡延長過程中起作用。當自噬開始時，哺動物 Atg9 與 LC3 結(jié)合，實現(xiàn)從反式高爾基網(wǎng)絡(luò)（TGN）到后期內(nèi)涵體endosome）的轉(zhuǎn)運。Atg9 從反式高爾基網(wǎng)絡(luò)（TGN）到后期內(nèi)涵體的再分配程決定于 ULK1 和 Atg13[129, 130]。

第 1 章 緒 論和其他泛素化的載體，運輸至自噬體完成自噬降解[137, 138]。哺乳動物蛋白 p62和酵母蛋白 Atg19的 C 端模序在結(jié)構(gòu)和功能上的相似性產(chǎn)生了一個假說，即p62是 Atg19 在高等真核生物中的同源類似物，它們的作用是作為細胞自噬中的受體，選擇性招募泛素化蛋白或泛素化細胞器至自噬體[139]。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Juliana Garcia de Oliveira;Ana Elizabete Silva;;Polymorphisms of the TLR2 and TLR4 genes are associated with risk of gastric cancer in a Brazilian population[J];World Journal of Gastroenterology;2012年11期

本文編號：2798275