【摘要】：目的探討家蠅甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)基因在不同飼料飼養(yǎng)、不同發(fā)育期及不同組織的轉(zhuǎn)錄和表達情況,評價其作為家蠅功能基因研究內(nèi)參的穩(wěn)定性。方法運用PCR技術擴增GAPDH基因完整編碼序列,生物信息學方法預測該基因及其編碼蛋白功能。構建pET-28a(+)-GAPDH重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌Transetta(DE3)中進行誘導表達,純化重組蛋白制備多克隆抗體。運用Real-time PCR和Western blot檢測家蠅不同發(fā)育期、三齡幼蟲不同組織和不同飼養(yǎng)物處理下GAPDH基因的表達情況。結果家蠅GAPDH基因ORF全長999bp,編碼332個氨基酸,理論分子質(zhì)量37.3ku,等電點為8.57,具有GAPDH家族的蛋白保守結構域;構建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR及測序鑒定正確;SDS-PAGE分析顯示重組質(zhì)粒在Transetta(DE3)中表達,純化后的表達產(chǎn)物與目的蛋白大小相符,Western blot顯示該蛋白可被相應血清識別;Real-time PCR分析GAPDH基因在不同飼料飼養(yǎng)3齡幼蟲、不同發(fā)育期均保持較好的轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性,同時,Western blot分析GAPDH分子在家蠅不同發(fā)育期及3齡幼蟲不同組織中均有表達,且表達量無明顯差別。結論 GAPDH基因在不同發(fā)育期、不同組織及不同飼養(yǎng)物飼養(yǎng)的家蠅表達穩(wěn)定,可作為家蠅可靠性內(nèi)參基因使用。

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1 楊劍;張大川;梁樹堅;林政炯;;Crystallographic Studies of Molecular Asymmetry of Activesite Carboxymethylated GAPDH[J];Chinese Science Bulletin;1993年12期

2 李潔;謝文光;沈倍奮;邵寧生;;GAPDH功能多樣性研究進展[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2006年05期

3 尚海旭;井然;賈弘y

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