【摘要】：背景剛地弓形蟲(chóng)(Toxoplasma gondii,簡(jiǎn)稱(chēng)弓形蟲(chóng))是一種專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的原蟲(chóng),可以引起人獸共患弓形蟲(chóng)病,其宿主范圍廣泛,包括大多數(shù)溫血?jiǎng)游镆约叭祟?lèi)。在宿主免疫功能低下時(shí)(如艾滋病、長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑者等),弓形蟲(chóng)感染可導(dǎo)致嚴(yán)重后果。而孕婦在懷孕期間發(fā)生原發(fā)性感染,可引起胎兒先天性弓形蟲(chóng)病,嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致流產(chǎn)、畸胎或死產(chǎn)。弓形蟲(chóng)病還嚴(yán)重威脅著畜牧業(yè)的發(fā)展。弓形蟲(chóng)表達(dá)幾種蛋白酶,其中包括絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶,它們?cè)诠蜗x(chóng)感染宿主、生存和分化的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。扁菱形蛋白酶(Rhomboid proteases,ROM)屬于絲氨酸蛋白酶家族。剛地弓形蟲(chóng)表達(dá)五種非線粒體扁菱形蛋白酶,即TgROM1-TgROM5。扁菱形蛋白酶在弓形蟲(chóng)入侵宿主時(shí)起著重要的作用。TgROM1在弓形蟲(chóng)的速殖子和緩殖子中均可表達(dá);TgROM2和TgROM3主要表達(dá)于弓形蟲(chóng)子孢子期。TgROM4在速殖子和緩殖子中都表達(dá),并且均勻分布在弓形蟲(chóng)表面;在弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞時(shí),TgROM4在調(diào)控微線體蛋白2(microneme protein 2,MIC2)、MIC3、MIC6 和頂端膜抗原 1(Apical membrane antigen 1,AMA1)中發(fā)揮著重要作用。TgROM5主要表達(dá)在弓形蟲(chóng)速殖子階段,它參與了弓形蟲(chóng)MIC6、MIC12等的酶解。組織蛋白酶(cathepsin)屬于半胱氨酸蛋白酶,半胱氨酸蛋白酶在宿主-寄生蟲(chóng)的相互作用中發(fā)揮重要作用。弓形蟲(chóng)基因組編碼5種組織蛋白酶,分別為組織蛋白酶 B(cathepsinB,TgCPB)、組織蛋白酶 L(cathepsinL,TgCPL)和 3 種組織蛋白酶C(TgCPC1,2和3)。組織蛋白酶C是弓形蟲(chóng)速殖子生長(zhǎng)和分化所需的外肽酶。這些蛋白酶的抑制可導(dǎo)致弓形蟲(chóng)感染的明顯減弱。TgCPC1和TgCPC2可表達(dá)在弓形蟲(chóng)速殖子中,主要位于致密顆粒和速殖子的納蟲(chóng)空泡(parasitophorous vacuole,PV)中。PV在寄生蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞時(shí)形成。TgCPC1或TgCPC2至少其中之一是弓形蟲(chóng)侵入宿主細(xì)胞和生長(zhǎng)所必需的,并且TgCPC1在弓形蟲(chóng)速殖子中高水平表達(dá),但關(guān)于TgCPC1免疫原性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。而在弓形蟲(chóng)速殖子中未檢測(cè)到 TgCPC3。速殖子(tachyzoite)、包囊(cyst)和卵囊(oocyst))是弓形蟲(chóng)生命周期中具有感染能力的主要階段。目前治療弓形蟲(chóng)速殖子引起的急性感染的藥物有許多副作用,特別對(duì)胎兒;并且尚無(wú)有效藥物治療弓形蟲(chóng)包囊感染。所以安全有效的疫苗對(duì)弓形蟲(chóng)病的預(yù)防和控制至關(guān)重要。弓形蟲(chóng)疫苗的研究主要包括全蟲(chóng)疫苗、蟲(chóng)體特異組分疫苗和核酸疫苗�？烧T導(dǎo)持久而強(qiáng)烈保護(hù)性免疫反應(yīng)的DNA疫苗是一種有前途的選擇。弓形蟲(chóng)上這些重要的參與弓形蟲(chóng)生命活動(dòng)的蛋白是很好的DNA疫苗候選靶點(diǎn)。如研究表明弓形蟲(chóng)表面抗原1(surface antigen 1,SAG1)是一種經(jīng)典的優(yōu)秀弓形蟲(chóng)DNA疫苗候選者;TgROM1的DNA疫苗、TgCPB的DNA疫苗和TgCPL的DNA疫苗對(duì)弓形蟲(chóng)的感染均具有一定的保護(hù)性。生物信息學(xué)是涉及多領(lǐng)域的交叉學(xué)科。它已被廣泛用于分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能,及預(yù)測(cè)抗原表位。表位預(yù)測(cè)在弓形蟲(chóng)疫苗研究中發(fā)揮重要作用。尚未見(jiàn)關(guān)于TgROM4和TgCPC1的生物信息學(xué)分析的報(bào)道。影響疫苗免疫效果的因素有很多,免疫策略是決定免疫應(yīng)答有效性的重要因素,并且在疫苗研究中越來(lái)越重要。初免-加強(qiáng)(prime-boost)免疫策略能夠更有效地誘導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。佐劑可明顯增強(qiáng)疫苗的免疫應(yīng)答效果,經(jīng)典佐劑有鋁鹽佐劑、弗氏佐劑等。α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)是一種有力的自然殺傷T細(xì)胞激動(dòng)劑,可有效刺激自然殺傷T細(xì)胞;有研究表明,α-GalCer可增強(qiáng)某些疫苗的免疫效果。在本研究中,我們使用生物信息學(xué)的方法分析預(yù)測(cè)了弓形蟲(chóng)ROM4和CPC1蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和抗原表位,構(gòu)建了基于這兩種蛋白的抗弓形蟲(chóng)DNA疫苗,進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估其免疫效果,并使用不同的方案來(lái)增強(qiáng)它們的免疫效應(yīng)。目的應(yīng)用生物信息學(xué)的方法分析預(yù)測(cè)弓形蟲(chóng)ROM4、CPC1蛋白的基本特性;預(yù)測(cè)它們潛在的T、B細(xì)胞抗原表位,為后續(xù)弓形蟲(chóng)DNA疫苗的構(gòu)建提供理論依據(jù)。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建ROM4DNA疫苗,并使用初免-加強(qiáng)免疫策略進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)估其免疫效果;構(gòu)建CPC1 DNA疫苗,聯(lián)合佐劑α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)進(jìn)行免疫小鼠來(lái)評(píng)估免疫效果。本研究為弓形蟲(chóng)疫苗的靶點(diǎn)選擇和免疫策略的優(yōu)化奠定了一定的理論基礎(chǔ)。方法1.生物信息學(xué)分析:(1)分別使用在線分析軟件 ProtParam、NetPhos 2.0Server、CSS-Palm Online Service、TMHMM Serverv.2.0、PSORT Ⅱ Prediction 分析預(yù)測(cè)弓形蟲(chóng) ROM4和CPC1蛋白的基本理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)、�；稽c(diǎn)、跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位。(2)應(yīng)用DNASTAR軟件分析預(yù)測(cè)ROM4和CPC1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和潛在B細(xì)胞抗原表位。(3)使用在線分析軟件IEDB預(yù)測(cè)ROM4和CPC1蛋白的潛在T細(xì)胞抗原表位。(4)將ROM4和CPC1蛋白的潛在抗原表位與弓形蟲(chóng)DNA疫苗經(jīng)典候選蛋白SAG1的抗原表位相比較。2.載體構(gòu)建與驗(yàn)證:(1)在對(duì)弓形蟲(chóng)ROM4和CPC1蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析的理論基礎(chǔ)上,進(jìn)行弓形蟲(chóng)DNA疫苗的構(gòu)建。首先,通過(guò)PCR的方法分別獲得TgROM4和TgCPC1的目的基因。(2)先后經(jīng)過(guò)雙酶切和連接,將TgROM4和TgCPC1基因分別與真核表達(dá)載體pEGFP-C1相連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-ROM4(pROM4)和pEGFP-CPC1(pCPC1),并進(jìn)行雙酶切實(shí)驗(yàn)及測(cè)序來(lái)驗(yàn)證構(gòu)建是否成功。(3)將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pROM4和pCPC1轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行大量提取,然后分別轉(zhuǎn)染到HEK 293-T細(xì)胞中并提取蛋白,進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn),來(lái)驗(yàn)證重組質(zhì)粒是否可以在真核細(xì)胞中成功表達(dá)目的蛋白。驗(yàn)證成功后,使用不同的方案免疫BALB/c小鼠來(lái)評(píng)估上述DNA疫苗的免疫效果。3.基于TgROM4的疫苗效果評(píng)估實(shí)驗(yàn)根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果選擇ROM4蛋白上一段具有良好抗原性的多肽(YALLGALIPYCVEYWKSIPR)進(jìn)行合成,并使用DNA疫苗初免-肽加強(qiáng)的方案進(jìn)行免疫小鼠。將BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組,包括3個(gè)免疫組(肽免疫組,pROM4免疫組和pROM4/肽免疫組)和2個(gè)陰性對(duì)照組(PBS組和pEGFP-C1組)。然后將小鼠肌內(nèi)免疫四次,其中pROM4/肽免疫組小鼠先后分別免疫pROM4和多肽各兩次。免疫后,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定各組小鼠血清中IgG、IgG2a和IgG1水平;脾細(xì)胞培養(yǎng)后,檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10和IL-12的水平;用弓形蟲(chóng)RH株速殖子攻擊小鼠并評(píng)估小鼠的存活時(shí)間。此外,用弓形蟲(chóng)PRU株包囊對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃后測(cè)定其腦內(nèi)包囊的數(shù)量。4.基于TgCPC1的DNA疫苗效果評(píng)估實(shí)驗(yàn)將BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組,分別為2個(gè)免疫組(pCPC1組和pCPC1/α-GalCer 組)和 3 個(gè)對(duì)照組(PBS 組、pEGFP-C1 組和 α-GalCer 組)。將小鼠肌內(nèi)免疫三次,其中pCPC1/α-GalCer組小鼠前兩次免疫pCPC1,第三次同時(shí)免疫pCPC1和α-GalCer。免疫后,采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定各組小鼠血清中IgG、IgG2a和IgG1水平;脾細(xì)胞培養(yǎng)后,檢測(cè)細(xì)胞因子水平;用弓形蟲(chóng)RH株速殖子攻擊小鼠并記錄小鼠的存活時(shí)間。結(jié)果1.通過(guò)生物信息學(xué)軟件分析預(yù)測(cè),我們獲得了弓形蟲(chóng)ROM4和CPC1蛋白的理化性質(zhì)、磷酸化位點(diǎn)和�；稽c(diǎn)、亞細(xì)胞定位、跨膜結(jié)構(gòu)等基本信息,預(yù)測(cè)了這兩種蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu);預(yù)測(cè)了它們的抗原表位,發(fā)現(xiàn)ROM4和CPC1蛋白與SAG1一樣均具有多個(gè)潛在的優(yōu)秀B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原表位。這為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。2.在上述理論分析的基礎(chǔ)上,通過(guò)PCR、酶切、連接等方法我們成功構(gòu)建了DNA 疫苗,即 pEGFP-ROM4(pROM4)和 pEGFP-CPC1(pCPC1),并成功進(jìn)行了驗(yàn)證。然后我們使用不同的策略免疫小鼠來(lái)評(píng)估其免疫效果。(1)基于TgROM4的疫苗效果評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果用不同免疫方案接種的小鼠(肽免疫組,pROM4組和pROM4/肽免疫組)均引發(fā)了特異性體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答,產(chǎn)生了高水平的IgG、IgG2a、IL-2、IL-12和IFN-γ(與陰性對(duì)照組相比,P0.05),并且pROM4/肽免疫組的水平最高。而小鼠IgG1、IL-4和IL-10水平在五組間均無(wú)明顯差別(P0.05)。用速殖子攻擊后,實(shí)驗(yàn)組小鼠(肽免疫組,pROM4組和pROM4/肽免疫組)的生存時(shí)間均比陰性對(duì)照組明顯延長(zhǎng),其中pROM4/肽免疫組小鼠生存時(shí)間最長(zhǎng)。用包囊感染后,實(shí)驗(yàn)組小鼠腦包囊數(shù)目比陰性對(duì)照組明顯減少,其中pROM4/肽免疫組小鼠腦包囊數(shù)目最少。(2)基于TgCPC1的DNA疫苗效果評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果與陰性對(duì)照組(PBS組、pEGFP-C1組或α-GalCer組)相比,免疫組(pCPC1組和pCPC1/α-GalCer組)小鼠IgG、IgG2a、IL-2和IFN-y水平明顯升高,并且pCPC1/α-GalCer組水平最高。α-GalCer組小鼠IL-4水平輕度升高,與PBS組相比pCPC1組IL-4水平無(wú)明顯改變。小鼠IgG1和IL-10水平在五組間均無(wú)明顯差異。用速殖子攻擊后,免疫組小鼠的生存時(shí)間均比陰性對(duì)照組延長(zhǎng),其中pCPC1/α-GalCer組小鼠生存時(shí)間延長(zhǎng)最多。結(jié)論我們首次通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)弓形蟲(chóng)ROM4蛋白和CPC1蛋白進(jìn)行了分析預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)在理論上它們均具有良好的B細(xì)胞抗原和T細(xì)胞抗原,有成為弓形蟲(chóng)DNA疫苗的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,TgROM4和TgCPC1都是弓形蟲(chóng)DNA疫苗的優(yōu)秀候選者。并且我們首次采用了 DNA疫苗初免-肽加強(qiáng)方案增強(qiáng)了 ROM4DNA疫苗的免疫效果,也首次采用佐劑α-GalCer增強(qiáng)了新的弓形蟲(chóng)DNA疫苗靶點(diǎn)CPC1的免疫效果。這說(shuō)明DNA疫苗初免-肽加強(qiáng)免疫策略和應(yīng)用佐劑都是提高弓形蟲(chóng)DNA疫苗免疫效應(yīng)的有前途的方法。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R392
【圖文】：

Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｐｏｓｉｔｉｏｎ逡逑圖１：邋ＴｇＲ0Ｍ４蛋白中預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)逡逑Ｆｉｇ．邋１邋Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅｓ邋ｉｎ邋ＴｇＲＯＭ４邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑ＭｅｔＰｈｏｓ邋３．１ａ：邋ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙ１邋ａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅｓ邋ｉｎ邋９ｉ邋２３２３５７０９邋ｄｂｊ邋ＢＤ１４逡逑１邐ｉ邐１邐１邐１邐１邐１逡逑

圖２：邋ＴｇＣＰＣＩ蛋白中預(yù)測(cè)的磷酸化位點(diǎn)逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ邋ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ邋ｓｉｔｅｓ邋ｉｎ邋ＴｇＣＰＣＩ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑３．２邋ＴｇＲＯＭ４和ＴｇＣＰＣＩ蛋白的�；稽c(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果逡逑

４．蛋白ＴｇＲ０Ｍ４和ＴｇＧＰＣＩ的跨膜結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)逡逑４．１邋ＴｇＲＯＭ４和ＴｇＣＰＣＩ蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果逡逑分別如圖３和圖４所示。ＴｇＲＯＭ４蛋白上存在６個(gè)跨膜區(qū)，分別位于３４５－３６４逡逑位氨基酸、３６９－３９１位氨基酸、３９６￣４１８位氨基酸、４２５＊４４７位氨基酸、４５２４７４位逡逑氨基酸和５５６－５７８位氨基酸

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2774171