【摘要】：新發(fā)現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒(Middle East Respiratory Syndrome coronavirus, MERS-CoV)能夠引起人類嚴(yán)重甚至致命的呼吸系統(tǒng)疾病,其致死率超過(guò)SARS病毒(-10%),達(dá)到37%。然而迄今為止沒有有效的治療和預(yù)防方法。中和抗體在多種病毒感染中可以保護(hù)宿主免受病毒感染,減緩疾病進(jìn)程,減輕臨床癥狀。因此,中和抗體具有重要臨床應(yīng)用的價(jià)值,能夠?yàn)槲磥?lái)可能發(fā)生的大流行提供重要的戰(zhàn)略儲(chǔ)備。MERS-CoV的侵染主要依賴于病毒表面的囊膜蛋白S糖蛋白中的受體結(jié)合區(qū)(Receptor binding domain, RBD)與受體二肽基肽酶(DPP4,又稱CD26)之間的相互作用。MERS-RBD主要負(fù)責(zé)病毒識(shí)別受體并與之結(jié)合。因此,RBD是MERS-CoV的主要抗原表位。本研究中,利用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)以RBD為免疫原成功篩選出RBD特異的單克隆抗體2E6和4C2�？贵w2E6和4C2能夠阻礙RBD蛋白與受體CD26的結(jié)合并進(jìn)一步抑制MERS假病毒感染,其ICs0值分別為0.477μg/mL (～3.18 nM),1.4 μg/mL(～9.33nM)。通過(guò)表面等離子共振技術(shù)檢測(cè)2E6和4C2抗體與MERS-RBD結(jié)合的親和力分別為76 nM和138 nM。利用Octet RED96生物分子相互作用分析儀確定了4C2與2E6結(jié)合抗原時(shí)存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。通過(guò)解析4C2和MERS-RBD的復(fù)合物結(jié)構(gòu),闡明了4C2的中和機(jī)制主要是由于4C2與MERS-RBD結(jié)合形成空間位阻及4C2競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合CD26與MERS-RBD結(jié)合界面的氨基酸。根據(jù)結(jié)構(gòu)對(duì)4C2進(jìn)行了人源化改造并初步驗(yàn)證了抗體人源化后的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明抗體2E6、4C2以及4C2人源化抗體(4C2h)都是針對(duì)RBD的有效抑制劑,有希望可以作為預(yù)防和治療MERS冠狀病毒感染的候選抗體。
【學(xué)位授予單位】：安徽大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R392
【圖文】：

抗體的結(jié)構(gòu)逡逑體發(fā)揮功能的基本單位是一個(gè)免疫球蛋白單體，ＩｇＧ由四條多膚鏈組成，鏈為重鏈，Ｗ兩條短鏈為輕鏈。而控鏈和重鏈之間通過(guò)二硫鍵連接所形物結(jié)構(gòu)如圖＾７所示。逡逑Ｇ包含了兩個(gè)抗原結(jié)合的位點(diǎn)，單價(jià)的臂片段（Ｍｒ邋４５邋ｋＤａ）稱為Ｆａｅｎｔ邋ａｎｔｉｇｅｎ邋ｂｉｎｄｉｎｇ），是識(shí)別外來(lái)物的關(guān)鍵所在。重鏈和輕鏈的Ｆ化區(qū)段可變區(qū)與一恒定區(qū)�？勺儏^(qū)又稱為Ｆｖ區(qū)，是與抗體結(jié)合的最關(guān)鍵區(qū)域，區(qū)的互補(bǔ)位成型于抗體單體氨基酸鏈的末端，該區(qū)域稱為互補(bǔ)決定ｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ邋Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ邋Ｒｅｇｉｏｎ，邋ＣＤＲ）邋［６９］，也稱做高變區(qū)，是真正的部位。高變區(qū)被框架區(qū)（Ｆｒａｍｅ邋Ｒｅｇｉｏｎ，邋ＦＲ）隔開，ＦＲ區(qū)氨基酸序列。ＩｇＧ基部與它的Ｆａｂ臂的連接處稱為較鏈區(qū)（ｈｉｎｇｅｒｅｇｉｏｎ），長(zhǎng)度約為３

可變區(qū)的變化使該抗體可和某一個(gè)特定的抗原結(jié)合［７２］。Ｂ細(xì)胞通過(guò)Ｖ、Ｄ、Ｊ重逡逑排產(chǎn)生具備功能的蛋白后，因?yàn)榈任换蚺懦�，不能產(chǎn)生其它形狀的可變區(qū)。如逡逑圖１－８所示，每一個(gè)Ｂ細(xì)胞僅能產(chǎn)生某一種相同可變區(qū)的抗他氣抗體的免疫多樣逡逑性使其在免疫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。因此，抗體的治療作用不容忽視。逡逑Ｖｎ．２．．．ｎ）邐Ｃ邐Ｖ（１，２．．．ｎ）邋Ｄ（ＶＩ２）邐Ｃ逡逑

為進(jìn)一步確定抗體２Ｅ６和４Ｃ２是否競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合ＭＥＲＳ－ＲＢＤ，運(yùn)用Ｏｃｔｅｄ邋ＲＥＤ逡逑％分子相互作用分析儀進(jìn)行分析。首先將純化的ＭＥ艮Ｓ－ＲＢＤ固定在芯片表面，逡逑再分別與兩種抗體結(jié)合。如圖３－５所示。其中深蹤色的表示ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在結(jié)合有逡逑２Ｅ６Ｆ化時(shí)再結(jié)合４Ｃ２Ｆ化，結(jié)合曲線變化很�。粶\蹤色的表示ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在沒有逡逑結(jié)合２Ｅ６Ｆ化時(shí)結(jié)合４Ｃ２Ｆ化，結(jié)合曲線有明顯升高，這表明ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在結(jié)合有逡逑２Ｅ６Ｆ化的情況下其結(jié)合４Ｃ２Ｆ化的能力明顯下降。同樣地，其中深棟色的表示逡逑ＭＥ艮Ｓ－ＲＢＤ在結(jié)合有４Ｃ２Ｆ化時(shí)再結(jié)合２Ｅ６Ｆａｂ，結(jié)合曲線變化很小；淺蹤色的表逡逑示ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在沒有結(jié)合４Ｃ２Ｆ化時(shí)結(jié)合２Ｅ６Ｆ化，結(jié)合曲線有明顯升高，表明逡逑ＭＥＲＳ－ＲＢＤ在結(jié)合有４Ｃ２Ｆ化的情況下其結(jié)合２Ｅ６Ｆａｂ的能力明顯下降。結(jié)果說(shuō)明

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