【摘要】：目的:本文旨在探索造血系統(tǒng)特異性敲除beclin1雙等位基因后,對(duì)胚胎期造血器官肝臟及骨髓的影響,對(duì)骨髓造血干祖細(xì)胞數(shù)量及功能的影響,對(duì)各類功能性血細(xì)胞的影響。方法:(1)構(gòu)建造血系統(tǒng)特異性敲除beclin1雙等位基因的小鼠模型。采用造血系統(tǒng)特異性表達(dá)的Vav啟動(dòng)子,啟動(dòng)Cre酶的表達(dá),實(shí)現(xiàn)特異性敲除beclin1基因的第四號(hào)外顯子到第七號(hào)外顯子之間的序列,實(shí)現(xiàn)移碼突變,使beclin1基因功能喪失。(2)利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)從鼠尾中提取的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增,通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型鑒定。(3)將beclin1~(f/f)小鼠與beclin1+/f;Vav-iCre小鼠(本文簡寫為beclin1+/f)進(jìn)行雜交,對(duì)孕鼠進(jìn)行麻醉脫臼處死,剖腹產(chǎn)取出圍產(chǎn)期18.5天的胎鼠進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。(4)通過蘇木精-伊紅染色法(HE染色法)檢測(cè)胎鼠肝臟的病理學(xué)變化。將胎肝取出后置于4%多聚甲醛(PFA)中進(jìn)行固定,或?qū)⒄惶ナ笾糜?%PFA中進(jìn)行固定,檢測(cè)造血系統(tǒng)beclin1雙等位基因的敲除對(duì)胎肝等造血器官的影響。(5)通過三分類全自動(dòng)血液分析儀對(duì)胚胎期18.5天的胎鼠外周血中各類血細(xì)胞指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。(6)通過多色流式細(xì)胞分析儀對(duì)18.5天的胎鼠骨髓中的造血干細(xì)胞及造血祖細(xì)胞群的數(shù)量和比例進(jìn)行檢測(cè)分析。(7)通過體外克隆形成實(shí)驗(yàn)(CFU)對(duì)胚胎期18.5天的胎鼠骨髓中長程造血干細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞的克隆形成能力進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:(1)我們首先成功構(gòu)建了beclin1~(f/f)小鼠以及beclin1+/f;Vav-iCre小鼠,將兩種基因型小鼠雜交,所產(chǎn)生的子代中有基因型為beclin1~(f/f);Vav-iCre(本文簡寫為beclin1-/-)的小鼠,即造血系統(tǒng)中beclin1雙等位基因敲除的胎鼠。由于純合敲除小鼠在圍產(chǎn)期18.5-19.5天全部死亡,我們選取胚胎期18.5天的胎鼠進(jìn)行后續(xù)功能檢測(cè)。(2)beclin1~(f/f);Vav-iCre胎鼠的鼠尾基因組DNA,通過基因型鑒定可以檢測(cè)出基因敲除條帶,表明beclin1被成功敲除;凡是不帶Vav啟動(dòng)子的小鼠即野生型小鼠(本文簡稱為WT)無敲除條帶。(3)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠與野生型小鼠相比,體型偏小,顏色發(fā)白。(4)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠,胎肝的中央血管中紅細(xì)胞數(shù)量稀少,血竇不豐富,含有數(shù)量較多的有核細(xì)胞,存在髓外造血。肝臟在胚胎期15.5天開始出現(xiàn)缺血性壞死灶,在肝臟外觀上表現(xiàn)為白色斑塊。(5)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠外周血中,白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)增多,紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少并且紅細(xì)胞指標(biāo)異常,血小板計(jì)數(shù)增多但血小板功能異常。(6)胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre小鼠骨髓中造血干祖細(xì)胞群比例明顯降低。(7)CFU實(shí)驗(yàn)表明胚胎期18.5天的beclin1~(f/f);Vav-iCre胎鼠,骨髓中的長程造血干細(xì)胞及單個(gè)核細(xì)胞均失去克隆形成能力,骨髓造血重建能力嚴(yán)重受阻。結(jié)論:造血系統(tǒng)特異性敲除beclin1雙等位基因的小鼠,由于造血功能衰竭,導(dǎo)致純合敲除小鼠在圍產(chǎn)期全部死亡。純合敲除小鼠骨髓中的HSCs比例顯著降低,并且骨髓中HSCs造血重建能力嚴(yán)重受阻,完全分化的功能性血細(xì)胞計(jì)數(shù)及其參數(shù)異常。這些結(jié)果表明了Beclin1在胚胎期造血中的重要作用。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R363
【圖文】：

驗(yàn)結(jié)果 Vav-iCre 啟動(dòng)子介導(dǎo)的自噬基因特異性敲除對(duì)小鼠造血系統(tǒng)影響的初步活。從而提示 beclin1-/-小鼠在胚胎期 18.5 天至胚胎期 19.5 天之間死亡。于妊 18.5 天對(duì)孕鼠麻醉頸椎脫臼處死后，剖腹產(chǎn)取出胎鼠，發(fā)現(xiàn) beclin1-/-胎鼠體顯減小，身體發(fā)白（圖 2），推測(cè)造血系統(tǒng)中特異性敲除 beclin1 雙等位基因胎鼠產(chǎn)生嚴(yán)重的貧血癥狀。

lin1f/f與 beclin1+/f;Vav-icre 親本雜交所獲得的 600 多只胎鼠的基因型，19.5 天出生小鼠中無 beclin1-/-基因型小鼠，各基因型比例 WT：be-/-=67.7%：32.3%：0.0%；胚胎期 18.5 天的胎鼠各基因型比例 WT：bebeclin1-/-=51%：26.2%：22.4%。

圖 3. beclin1f/f;Vav-iCre 胎鼠體型偏小，顏色發(fā)白A）胚胎期 18.5 天野生型小鼠肝臟切片中血竇豐富，beclin1-/-小鼠的肝臟中中央血管中紅細(xì)胞數(shù)量稀少，血竇減少，有核細(xì)胞（黑色箭頭所指）明顯增多（上方切片放大倍數(shù)為 20 倍，下方切片放大倍數(shù)為 40 倍）；B）通過流式細(xì)胞分析儀對(duì)胎肝細(xì)胞及骨髓細(xì)胞中的有核細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)肝臟中該細(xì)胞比例增多，但骨髓中的有核細(xì)胞比率無差異。** P < 0.01

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