【摘要】：貝氏柯克斯體(Coxiella burnetii,簡稱C.burnetii)是一類世界范圍廣泛分布的革蘭陰性胞內(nèi)寄生菌,該菌通常以氣溶膠吸入的方式傳播感染人,引起人類急性或慢性Q熱病。傳統(tǒng)上,由于貝氏柯克斯體與立克次體具有相似的生物學(xué)特性,因而又俗稱Q熱立克次體。近年來研究發(fā)現(xiàn)貝氏柯克斯體與立克次體科內(nèi)其他成員的親緣關(guān)系較遠,在第二版的《伯杰氏系統(tǒng)細菌學(xué)手冊》中該菌歸屬于軍團菌目、柯克斯體科、柯克斯體屬。值得注意的是,該病原體對高滲透壓、干燥脫水等環(huán)境具有極強的抵抗存活特性,是一類經(jīng)典的生物戰(zhàn)劑與生物恐怖劑。脂多糖(Lipopolysaccharide,簡稱LPS)是大多數(shù)革蘭陰性細菌菌體外膜的主要結(jié)構(gòu),是一種重要的毒力因子。除少數(shù)菌例外如沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,簡稱Ct)等,均由類脂A、核心糖、多糖(O抗原)三部分組成,是重要的毒力因子與保護性抗原。類脂A是革蘭陰性菌的內(nèi)毒素,葡萄糖胺結(jié)構(gòu)的雙糖脂,脂多糖的基礎(chǔ)組分。目前除少數(shù)菌如腦膜炎奈瑟氏菌、卡他莫拉菌和鮑曼不動桿菌之外,Kdo-lipid A為大多數(shù)革蘭陰性菌正常生長繁殖的必需結(jié)構(gòu)。LpxC是類脂A合成途徑中催化第一步脫乙�；磻�(yīng)的保守酶,該反應(yīng)不可逆,常被用作革蘭陰性菌抗生素的設(shè)計靶點。新型小分子化合物抑制劑如LPC-011、CHIR-90能夠特異性結(jié)合抑制LpxC的活性,從而有效抑制類脂A的合成,達到化學(xué)法敲除類脂A的目的。近年來,關(guān)于貝氏柯克斯體脂多糖的研究中,類脂A的生物學(xué)作用與功能目前仍不明確。我們通過使用新型小分子LpxC抑制劑LPC-011、CHIR-90等,在無細胞培養(yǎng)基(ACCM-2)、猴腎細胞系(Vero、BGMK)、巨噬樣THP-1細胞等多種貝氏柯克斯體的培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)研究了類脂A對于菌體生長繁殖的重要性,初步分析了其生物學(xué)功能。此外,以無細胞培養(yǎng)體系為研究平臺,利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)篩選出多個與菌體耐高滲透壓適應(yīng)性存活特性相關(guān)的蛋白。首先,初步研究發(fā)現(xiàn):初始加入單一高濃度的抑制劑LPC-011并不影響I相、II相貝氏柯克斯體在Vero細胞內(nèi)生長繁殖,這提示類脂A對于貝氏柯克斯體在該環(huán)境下的生長繁殖過程可能并不重要。然而,由于缺乏有效的類脂A檢測方法以及貝氏柯克斯體LpxC對于抑制劑的敏感性未知,因此并不能得出關(guān)于類脂A必要性的準確結(jié)論。為了進一步評價貝氏柯克斯體LpxC對于抑制劑LPC-011的敏感性(MIC),利用遺傳操作將貝氏柯克斯體lpxC基因引入大腸埃希菌(E.coli,簡稱大腸桿菌),同時敲除大腸桿菌內(nèi)源染色體上的lpxC完成構(gòu)建大腸桿菌替代測試模型。在大腸桿菌替代模型中對比測試發(fā)現(xiàn),抑制劑LPC-011對貝氏柯克斯體LpxC的最低抑制濃度小于0.05μg/ml,且小于LPC-011對大腸桿菌的最小抑菌濃度。這提示我們可以利用大腸桿菌作為參考指標,判斷抑制劑的穩(wěn)定性與抑制效果�？紤]到貝氏柯克斯體的培養(yǎng)周期長達7天,且抑制劑LPC-011在動物體內(nèi)實驗中不穩(wěn)定等特點,利用大腸桿菌的生長指標OD_(550)作為參照,評價抑制劑LPC-011的抑制效果。發(fā)現(xiàn)在細胞環(huán)境中,初始加入大腸桿菌致死劑量(2μg/ml40×MIC)的LPC-011能夠在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定的大腸桿菌抑菌濃度。因此間隔48 h更換含有2μg/ml LPC-011的培養(yǎng)液可保持大腸桿菌抑菌濃度。然而,在無細胞培養(yǎng)體系中,初始加入5μg/ml LPC-011經(jīng)培養(yǎng)7天后,仍可維持大腸桿菌抑菌濃度。由于缺乏類脂A檢測手段,實驗構(gòu)建了穿梭載體pMMBGK,進而引入衣原體kdtA成功構(gòu)建穿梭質(zhì)粒pMMBGKkdt A。以上兩種質(zhì)粒均具有RSF1010復(fù)制起始位點。將質(zhì)粒pMMBGKkdt A電轉(zhuǎn)化進入貝氏柯克斯體九里II株,使衣原體Kdo轉(zhuǎn)移酶Kdt A表達,催化合成衣原體屬特異性Kdo側(cè)鏈,修飾貝氏柯克斯體類脂A,將Kdo_2-lipid A修飾形成Kdo_3-lipid A,在貝氏柯克斯體外膜形成可被抗衣原體屬特異性單抗識別的α-Kdo-(2→8)-α-Kdo表位結(jié)構(gòu)。在抑制劑LPC-011作用下,通過間接免疫熒光染色驗證了貝氏柯克斯體類脂A的合成確實受到顯著抑制,同時親代轉(zhuǎn)化菌在非吞噬細胞、無細胞生長環(huán)境內(nèi)的拷貝數(shù)產(chǎn)量下降。經(jīng)抑制劑培養(yǎng)所得子代菌體能夠正常感染吞噬、非吞噬細胞,但在LPC-011的作用下幾乎不能在吞噬細胞THP-1中進行生長繁殖。然而,類脂A修飾菌的實驗結(jié)果并不能完全替代野生型貝氏柯克斯體的測試結(jié)果。在對野生型I相、II相貝氏柯克斯體的測試研究中發(fā)現(xiàn),在BGMK細胞培養(yǎng)體系中,LPC-011降低了囊泡數(shù)量(約60%~70%),但是已發(fā)育成熟囊泡內(nèi)菌體的生長繁殖未受影響。有意思的是,經(jīng)LPC-011處理的I相菌體,其囊泡內(nèi)菌體的生長表型仍表現(xiàn)為分散的布朗運動,這提示完整的脂多糖可能并不是導(dǎo)致I相菌體親水性的唯一原因。在經(jīng)抑制劑LPC-011處理的THP-1細胞中,貝氏柯克斯體僅可形成缺陷生長的小囊泡,同時菌體拷貝數(shù)下降顯著。經(jīng)LPC-011培養(yǎng)所得子代菌仍可感染THP-1細胞、在胞內(nèi)正常生長。由于貝氏柯克斯體發(fā)育過程中包含形態(tài)迥異的小貝氏體(SCV,直徑0.2~0.5μm)、大貝氏體(LCV,直徑1μm)的雙相發(fā)育周期,因此使用透射電子顯微鏡(TEM)分析類脂A對于菌體的形態(tài)學(xué)發(fā)育變化的生物學(xué)作用,發(fā)現(xiàn)在LPC-011處理的吞噬、非吞噬細胞中,類脂A并不是大貝氏體向小貝氏體發(fā)育變化的必需結(jié)構(gòu)。另外,通過改變無細胞培養(yǎng)體系中Na~+與Cl~-濃度來大量獲取不同滲透壓梯度下的菌體,并分別對三組:超高滲、正常高滲、低滲環(huán)境所得菌體蛋白進行雙向電泳分析銀染顯色�；诘鞍c灰度值,用軟件對比分析得出三組滲透壓條件下表達量具有顯著性差異的13個蛋白,進行質(zhì)譜(Maldi-TOF-MS)分析。其中,超高滲組中Gro ES、EF-Tu、RopC、IcmK、RplL蛋白以及假定蛋白(CBU_0632)的表達量均升高10倍以上。低滲組中,蛋白GcvH、Bcp、Dot C、、RuvB、鳥氨酸脫羧酶、以及假定蛋白(CBU_0658)的灰度變化均達10倍以上。綜上所述,本研究通過使用抑制劑LPC-011在多種培養(yǎng)體系內(nèi)鑒定了貝氏柯克斯體類脂A的生物學(xué)作用,利用大腸桿菌替代模型測試了貝氏柯克斯體LpxC對于LPC-011的敏感性,建立了一個基于間接免疫熒光染色的貝氏柯克斯體類脂A檢測報告系統(tǒng),進而提出證據(jù)證明貝氏柯克斯體類脂A在三種培養(yǎng)環(huán)境下(猴腎成纖維細胞、吞噬細胞、無細胞培養(yǎng)基),具有不同的生物學(xué)作用。另外,通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定得出與菌體耐高滲透壓特性相關(guān)的蛋白及其編碼基因。本研究為下一步構(gòu)建貝氏柯克斯體類脂A無痕刪除突變株奠定了基礎(chǔ),為更加深入分析類脂A的生物學(xué)功能提供了實驗依據(jù)。對臨床上治療急性、慢性Q熱提供了新的思路。也為進一步在轉(zhuǎn)錄水平研究貝氏柯克斯體耐高滲透壓的遺傳學(xué)機制、驗證相關(guān)基因的生物學(xué)功能提供了實驗基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：軍事科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R376
【圖文】：

圖 1.1 脂多糖合成途徑與 LpxC 抑制劑作用機制示意圖抑制劑（LPC-011，CHIR-90）特異性結(jié)合抑制 LpxC 的活性，進而有效抑制革蘭陰性菌類脂 A 與脂多糖的合成。圖 1.2 LPC-011 結(jié)合抑制 LpxC 三維結(jié)構(gòu)示意圖

第 7 頁圖 1.2 LPC-011 結(jié)合抑制 LpxC 三維結(jié)構(gòu)示意圖細胞與質(zhì)粒名稱 來源氏柯克斯體九里 II 相菌株柯克斯體 Henzerling I 相菌株 coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞E. coli TOP10 感受態(tài)細胞本實驗室收集保存本實驗室收集保存天根生化科技有限公司（北天根生化科技有限公司（北

軍事科學(xué)院博士學(xué)位論文入單一高濃度（2 μg，>40×MIC）抑制劑 LPC-011 抑制貝氏柯克斯體類脂 A 的合成。利用相差顯微鏡連續(xù)觀察囊泡、菌體的生長繁殖形態(tài)。觀察抑制劑 LPC-01對貝氏柯克斯體生長表型的影響，初步判斷類脂 A 對于貝氏柯克斯體在胞內(nèi)生長繁殖過程中是否具有重要的生物學(xué)作用。如圖 1.3 所示。

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本文編號：2744467