【摘要】：對大部分生命體來說,染色體的復(fù)制起始和調(diào)節(jié)是重要的生命活動(dòng)。能否正確地進(jìn)行復(fù)制起始決定了細(xì)胞的命運(yùn)。細(xì)胞需要在合適的環(huán)境下開始復(fù)制起始,又必須在惡劣的環(huán)境下阻止復(fù)制起始。在細(xì)菌中,復(fù)制起始蛋白DnaA是DNA復(fù)制起始過程的關(guān)鍵蛋白。在E.coli中有多種機(jī)制來確保染色體正確地復(fù)制起始,其中一部分機(jī)制是通過調(diào)控ATP-DnaA的活性來實(shí)現(xiàn)的,包括RIDA(Regulatory inactivation of DnaA)和DARS(DnaA-reactivating sequence)等。DnaA屬于AAA+蛋白家族成員,含有保守的Walker A及Walker B motifs。這兩個(gè)motifs對DnaA蛋白的ATP/ADP結(jié)合至關(guān)重要。近些年的研究發(fā)現(xiàn),蛋白賴氨酸的乙�；揎椩诩�(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著重要的角色。我們的研究表明,DnaA可以在體外被乙�；窹at及乙酰磷酸(acetyl-phosphate,AcP)乙�；揎�,也可以被去乙酰化酶CobB去乙�；揎�。為了更好地研究DnaA乙�；揎椀纳硪饬x,我們通過knock-in的方法在E.coli基因組上dnaA的N-端敲入His標(biāo)簽,并通過親和純化的方法獲得生理狀態(tài)DnaA。檢測生理狀態(tài)DnaA乙�；�,我們發(fā)現(xiàn)E.coli WT菌株中,從遲緩期到平臺期,DnaA乙酰化程度逐漸升高。與WT中DnaA乙�；较啾�,?cobB菌株中DnaA乙酰化水平上升,而?pat菌株中DnaA乙�；较陆�。AckA為乙酸激酶,可以把乙酰磷酸轉(zhuǎn)化為乙酸;Pta為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶,可以把乙酰磷酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A。我們構(gòu)建了E.coli的ackA-pta雙敲株,ackA-pta雙敲株的胞內(nèi)乙酰磷酸濃度較低。我們還發(fā)現(xiàn),?ackApta菌株中平臺期DnaA乙�；矫黠@下降。細(xì)胞周期分析表明,與WT相比,?cobB、?pat、?ackApta菌株DNA復(fù)制起始頻率也發(fā)生了變化。這表明生理狀態(tài)下,CobB/Pat及乙酰磷酸都參與調(diào)節(jié)了DnaA的乙酰化修飾并影響了DNA的復(fù)制起始頻率。通過LC/ESI/MS鑒定,我們發(fā)現(xiàn)生理狀態(tài)下DnaA的23個(gè)賴氨酸位點(diǎn)中有17個(gè)位點(diǎn)被乙�；揎�,其中有位于比較保守的Walker A motif上的K178位,通過質(zhì)粒互補(bǔ)試驗(yàn)篩選,該位點(diǎn)比較重要。對該位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)乙�；揎椇髾z測其功能,發(fā)現(xiàn)DnaA(K178Ac)喪失了與ATP及ADP的結(jié)合能力,與復(fù)制起始點(diǎn)oriC的結(jié)合能力有很大程度的減弱。這表明,K178的乙酰化修飾可以降低DnaA的活性。而且DnaA(K178Ac)與dnaA啟動(dòng)子的結(jié)合能力也減弱了,這表明DnaA的乙�；揎椨锌赡芤矃⑴c了dnaA基因轉(zhuǎn)錄的自調(diào)控過程。除此之外,我們還發(fā)現(xiàn)K178位的乙�；揎椏梢员籆obB去除。以上的發(fā)現(xiàn)表明E.coli可以通過調(diào)節(jié)DnaA的乙�；揎梺砀淖僁naA的活性進(jìn)而對DNA的復(fù)制起始頻率進(jìn)行調(diào)節(jié)。這是一個(gè)全新的復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制,我們的研究拓寬了人們對原核生物復(fù)制起始調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R378
【圖文】：

物中 DNA 聚合酶 除外），只能從一個(gè)已存在的 3'端羥基始 DNA 合成所必需的[24]。腸桿菌中，已發(fā)現(xiàn) 5 種 DNA 聚合酶，分別為 DNA 聚合酶 中聚合酶 III 為多亞基復(fù)合體，負(fù)責(zé)從頭合成新鏈 DNA， DNA 的修復(fù)[25, 26]。在真核生物中，有 9 種 DNA 聚合酶細(xì)胞核 DNA 的復(fù)制，γ 負(fù)責(zé)線粒體中 DNA 的合成，其它核 DNA 的修復(fù)（β、ζ、κ、η）或減數(shù)分裂（ι）[27]。桿菌的 DNA 聚合酶 III 全酶（holoenzyme）由 10 個(gè)蛋白質(zhì)包括兩份拷貝的催化核心（ 亞基、 亞基、θ 亞基），兩份蛋白（τ 亞基），兩份拷貝的具有前進(jìn)能力的 β 夾鉗及 5 個(gè)蛋機(jī)（圖 1）[28, 29]。β 夾鉗控制了核心酶與蛋白質(zhì)的結(jié)合，NA 鏈上快速滑動(dòng)，而兩份拷貝的催化核心可以同時(shí)合成先導(dǎo)岡崎片段（Okazaki fragment）[29, 30]。

基因的一部分。引物 His-Ec DnaAR1，F(xiàn)2，R2，F(xiàn)3，R3，F(xiàn)4 皆含有相鄰片段的20 個(gè)堿基，這對融合 PCR 成功與否非常關(guān)鍵。圖7 基因組 dnaA 原位敲入6HIS 標(biāo)簽示意圖Figure 7 The schematic of the fused with a 6HIS-tag at the N-terminus of chromosomal dnaA2.2.3.4 PCR 產(chǎn)物的制備融合 PCR 比普通 PCR 稍顯復(fù)雜，PCR 產(chǎn)物須三步反應(yīng)才能得到。步驟如下：1. 融合片段的制備：分別以 His-Ec DnaA F1，R1（退火溫度：45 ℃）、F2，R2（退火溫度：49 ℃）、F3，R3（退火溫度：45 ℃）、F4，R4（退火溫度：55 ℃）為引物，以 MG1655基因組或 pKD3為模板，擴(kuò)增出要融合的4個(gè) DNA 片段。50μLPCR 反應(yīng)體系如下：10×Pfu buffer（含 MgCl2） 5 μL2.5 mM dNTP 5 μL10 μM Primer F 1 μL10 μM Primer R 1 μLTemplate DNA 0.5 μLPfu polymerase 0.6 Udd H2O 36.9 μLPCR 反應(yīng)結(jié)束后用1% Agarose 膠電泳鑒定片段的純度與濃度

將膜表面用濾紙輕輕吸干，使 A、B 混合液均勻平鋪n 后通過化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測顯色結(jié)果。保存圖片后對圖片通灰度掃描，計(jì)算出相對灰度值，分析蛋白水平及乙酰化水平結(jié)果狀態(tài) DnaA 蛋白的獲得材料與方法中敘述的步驟，我們獲得了 DnaA 蛋白的表達(dá)質(zhì)cdnaA，并將該質(zhì)粒置于表達(dá)菌株 BL21 中誘導(dǎo)表達(dá)，最終純的 DnaA 蛋白，見圖 8 箭頭所指處。我們選擇 desalting-6 泳后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵摴艿鞍自诩兌壬舷鄬^高。

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3 吳N諍

本文編號：2744374