發(fā)布時(shí)間：2020-05-28 02:55

【摘要】：器官移植是中晚期器官衰竭患者重要的治療方法,為解決臨床供體短缺問題人們將目光投向了異種移植。豬在生理學(xué)特性、器官匹配度等方面與人類極為相似,且具有繁殖率高、遺傳性狀穩(wěn)定等特點(diǎn),是最適合異種移植的供體。所有豬源細(xì)胞均存在豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒(Porcine endogenous retrovirus,PERV),完整的病毒粒子可釋放到胞外。它以前病毒、多拷貝方式整合在宿主基因組中,不能用常規(guī)的培育無特定病原體(Specefic pathogen free,SPF)豬、免疫抑制等方法去除。已證實(shí)PERV可在體外感染多種人源細(xì)胞,且與致瘤性的鼠白血病病毒(Murine leukemia virus,MLV)、貓白血病病毒(Feline leukemia virus,Fe LV)等C型反轉(zhuǎn)錄病毒有相似的整合方式,這些都引起人們對(duì)異種移植誘發(fā)人獸共患病的擔(dān)憂。歐洲藥品管理局(EMEA)和美國食品藥物管理局(FDA)相繼頒布的行業(yè)指南,對(duì)臨床異種移植的倫理問題與病原安全性做出了明確的規(guī)定;國際異種移植協(xié)會(huì)(IXA)發(fā)布了無指定病原體(Designated pathogen free,DPF)豬的病原體名錄,也詳細(xì)描述了Ⅰ型糖尿病豬胰島產(chǎn)品在進(jìn)行臨床試驗(yàn)時(shí)的條件~([1])。為了充分利用我國豐富的小型豬資源,實(shí)驗(yàn)室在前期工作中已對(duì)我國多種小型豬種的PERV拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明,與貴州香豬、巴馬小型豬等相比五指山小型豬具有PERV-A型、PERV-B型拷貝數(shù)低且無PERV-C型等優(yōu)勢(shì),同時(shí)該近交系是連續(xù)20代以上的近親交配,基因純合度達(dá)到60%以上,易于構(gòu)建醫(yī)用模型。因此,我們有望通過在選育的低拷貝五指山小型豬近交系中篩選出PERV基因缺陷型小型豬,進(jìn)而培養(yǎng)出為臨床提供異種移植器官供體的新品系。本研究主要進(jìn)行的工作內(nèi)容包括對(duì)五指山小型豬近交系進(jìn)行初步篩選,并經(jīng)過確證實(shí)驗(yàn)得到無PERV傳染性豬,做反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè),對(duì)其中1頭豬做全基因組重測(cè)序。1、無PERV傳染性五指山小型豬的初步篩選采集五指山小型豬的股動(dòng)脈血,分離PBMC細(xì)胞與HEK293細(xì)胞共培養(yǎng)4天后去除PBMC,提取HEK293細(xì)胞的總RNA,運(yùn)用RT-PCR方法,檢測(cè)PERV結(jié)構(gòu)基因gag、pol、env的表達(dá)情況,初步篩選出不釋放嗜人性PERV的小型豬作為候選。結(jié)果顯示105份HEK293細(xì)胞中有17份不存在PERV的表達(dá),其對(duì)應(yīng)的小型豬為候選無PERV傳染性小型豬。2、無PERV傳染性五指山小型豬的確證將與候選豬PBMC共培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)30~60天,每周收集一次細(xì)胞基因組DNA及總RNA,PCR及RT-PCR檢測(cè)HEK293細(xì)胞中是否有新出現(xiàn)的PERV結(jié)構(gòu)基因,篩選出結(jié)果始終為陰性的樣品。結(jié)果顯示17份樣品中12份始終無PERV存在與表達(dá)。在HEK293細(xì)胞培養(yǎng)過程中,每次傳代前收集細(xì)胞上清,經(jīng)處理后做反轉(zhuǎn)錄酶活性檢測(cè)。測(cè)量的OD405值小于標(biāo)準(zhǔn)曲線縱軸截距的2倍即為無效值,說明無反轉(zhuǎn)錄酶活性。若始終檢測(cè)不到反轉(zhuǎn)錄酶活性,說明無PERV病毒粒子釋放到胞外,則驗(yàn)證該頭豬確為無PERV傳染性五指山小型豬。結(jié)果顯示12份樣品中有8份始終檢測(cè)不到反轉(zhuǎn)錄酶活性,該8頭豬確為無PERV傳染性五指山小型豬。3、無PERV傳染性豬全基因組序列測(cè)定對(duì)其中1頭生長狀況良好的無PERV傳染性五指山小型豬(體號(hào):452)進(jìn)行全基因組重測(cè)序,提取其PBMC細(xì)胞的基因組DNA,利用IlluminaHiSeq 4000平臺(tái)完成,選定的參考基因組為F_(20)五指山近交系豬(Gen Bank:AJKK01000000.1)。對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制,結(jié)果表明測(cè)序質(zhì)量好。對(duì)測(cè)序結(jié)果、與參考基因組比對(duì)結(jié)果、變異信息注釋結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。提取WZSP452中所有PERV-pol基因片段發(fā)現(xiàn)序列均不完整;分析WZSP452中唯一包含gag、pol、env結(jié)構(gòu)基因的scaffold5028得出,三個(gè)基因均提前終止,未完全表達(dá)。4、帶有N堿基的pol序列基因克隆與序列分析為獲得scaffold640的pol中缺失N堿基的準(zhǔn)確序列信息,設(shè)計(jì)并合成452號(hào)豬scaffold640 pol上下游引物,用PCR的方法擴(kuò)增scaffold640 pol全長,與p MD-18T載體相連后在E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中轉(zhuǎn)化,對(duì)菌落PCR鑒定及雙酶切鑒定正確的陽性質(zhì)粒測(cè)序。測(cè)序信息與全基因組序列結(jié)果進(jìn)行比對(duì)從而獲得N堿基的完整信息。我們通過對(duì)篩選出的無PERV傳染性五指山小型豬中的一頭進(jìn)行全基因組重測(cè)序,鑒定出是PERV-pol基因缺陷型豬。這是國內(nèi)外首次通過近交培育結(jié)合自然篩選方法獲得,具有經(jīng)濟(jì)、安全等優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果推動(dòng)了五指山小型豬PERV缺陷型新品系的建立,有利于我國小型豬的開發(fā)和利用,為異種移植提供合適供體。
【圖文】：

ERV 是 C 型 RNA 病毒，屬哺乳動(dòng)物反轉(zhuǎn)錄動(dòng)物科（Retroviridae毒屬（Mammalian retroviridae），以前病毒的形式整合在宿主基隨染色體的復(fù)制而復(fù)制[38~40]。它最早是在 1971 年由 Armstrong內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性病毒粒子[41]。PERV 的基因結(jié)構(gòu)是單股、正，單體長 7~9kb，兩端是 5'、3'非編碼區(qū)（noncoding region），、pol、env 三個(gè)編碼基因，，5'端有甲基化帽結(jié)構(gòu)，3'端有多聚 A 尾（ 1）。兩端的長末端重復(fù)序列（Long terminal repeat, LTR）具有功能，可調(diào)控病毒轉(zhuǎn)錄、復(fù)制與整合[42]；gag 區(qū)可編碼核心蛋白，如衣殼蛋白、基質(zhì)蛋白等；pol 區(qū)可編碼反轉(zhuǎn)錄酶（RT）、蛋和整合酶（IN），對(duì)于病毒反轉(zhuǎn)錄及整合入宿主基因組中尤為重可編碼病毒的囊膜蛋白[43]。

豬內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒 pol 基因篩選結(jié)果情況 細(xì)胞共培養(yǎng) 4 天后 3 遍以去除 PBMC基因的方法來檢測(cè) 為陽性對(duì)照，以無示：陽性對(duì)照在 50及陰性對(duì)照均未見預(yù)M a b c d e f
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2684590